參見圖40a 至40d(灰色點(diǎn)）。在圖39和40中，內(nèi)部的細(xì)虛線代表概率閾值為1/1000,外部的粗虛線 代表概率閾值為1/10000。
[0383] 一旦建立了每條染色體和每個(gè)參照組的參照?qǐng)D，就將獲自每個(gè)測(cè)試樣品的給定的 染色體的UES計(jì)數(shù)的值標(biāo)繪在相應(yīng)的參照?qǐng)D上。在圖39中，將單個(gè)測(cè)試樣品的13、16、18 和21號(hào)染色體的值在參照?qǐng)D上表示為被環(huán)繞的黑點(diǎn)。在圖40中，將四個(gè)不同測(cè)試樣品的 13、16、18和21號(hào)染色體的值在參照?qǐng)D上表示為被環(huán)繞的黑點(diǎn)。對(duì)具有所有染色體的所有 48個(gè)測(cè)試樣品以及所有參照組進(jìn)行了這項(xiàng)操作。
[0384] 結(jié)果清楚地證實(shí)本發(fā)明的測(cè)試允許極其可靠地檢測(cè)胎兒非整倍性。圖39a至39d 表明名為GWX-1137的樣品的13、16、18和21號(hào)染色體是正常的。圖40a至40d表明名為 GWX-1196、GWX-1420、GWX-1421和GWX-1470的樣品的13、16、18和21號(hào)染色體是正常的機(jī) 率分別小于1/10000。
[0385] 使用大小選擇步驟獲得的結(jié)果與沒(méi)有使用大小選擇獲得的那些的比較明確地表 明大小選擇有效富集胎兒分?jǐn)?shù)，如幾乎總是存在的增強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度所表明的，其導(dǎo)致更穩(wěn) 健的檢測(cè)，特別是對(duì)于低胎兒分?jǐn)?shù)。評(píng)估所有常染色體的信號(hào)強(qiáng)度。所有常染色體的比較 如圖17至38所示，其中x軸"GWX"是沒(méi)有進(jìn)行大小選擇的，y軸"TPR"是進(jìn)行大小選擇的。 大小選擇之后的信號(hào)強(qiáng)度在41/48或85%的情況下更強(qiáng)，并且在7/48或15%的情況下與 沒(méi)有進(jìn)行大小選擇的樣品相同。沒(méi)有一例在大小選擇后信號(hào)強(qiáng)度變?nèi)酢＿@個(gè)由大小選擇賦 予的改善的信號(hào)強(qiáng)度甚至在更少的用于計(jì)算所述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的UES的存在下也是可測(cè)量的。 事實(shí)上，在25%的比相應(yīng)的未經(jīng)大小選擇的樣品具有更少的UES的經(jīng)大小選擇的樣品中， 具有更高信號(hào)強(qiáng)度的部分仍然有83%。如13、16、18和21號(hào)染色體的信號(hào)強(qiáng)度比較的圖中 所示（圖29、32、34和37)，更穩(wěn)健地檢測(cè)到非整倍性，特別是對(duì)于低胎兒分?jǐn)?shù)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也 表明大小選擇過(guò)程沒(méi)有在常染色體的檢測(cè)中引入偏差。
[0386] 大小選擇過(guò)程還減少了潛在假陽(yáng)性結(jié)果。首先懷疑所使用的48個(gè)樣品中的9個(gè)為 病理性的：7個(gè)最終經(jīng)核型分析得到驗(yàn)證，兩個(gè)臨界例子在大小選擇后證明具有正常結(jié)果。
[0387] 總之，大小選擇步驟能全局性地改善信號(hào)強(qiáng)度，這導(dǎo)致對(duì)胎兒分?jǐn)?shù)的更穩(wěn)健的檢 測(cè)一一其對(duì)具有低胎兒分?jǐn)?shù)的臨界樣品特別有用。
[0388]實(shí)施例5 :經(jīng)大小詵擇的游離DNA樣品的非整倍件檢測(cè)（2)
[0389] 將實(shí)施例4所述的方案進(jìn)行調(diào)整以適用于使用基于半導(dǎo)體的NGS平臺(tái)而不是邊合 成邊測(cè)序平臺(tái)，同樣使用48個(gè)測(cè)試樣品。使用與用于分析測(cè)試樣品的相同的方法學(xué)一一包 括大小選擇和使用基于半導(dǎo)體的NGS平臺(tái)一一生成六個(gè)新的參照組。用于該平臺(tái)的文庫(kù)制 備使用平末端的接頭連接，并不包括dA加尾。此外，使用較低數(shù)量的PCR循環(huán)（8個(gè)而非15 個(gè)）。所述大小選擇步驟與實(shí)施例4中所述的相同。
[0390] 也使用基于半導(dǎo)體的NGS平臺(tái)連同使用邊合成邊測(cè)序平臺(tái)生成的參照樣品對(duì)所 述48個(gè)樣品進(jìn)行了測(cè)試。在該測(cè)試中，用于制備參照樣品的測(cè)序平臺(tái)是這兩組實(shí)驗(yàn)之間的 唯一差別。
[0391] 三個(gè)樣品的結(jié)果示于圖41a、b和c中。黑色粗條示出了使用相同方案制備測(cè)試樣 品和參照樣品時(shí)所獲得的結(jié)果。較小的細(xì)條代表用于制備樣品的測(cè)序平臺(tái)和用于制備參照 組的不同時(shí)所獲得的結(jié)果?？梢钥闯?，雖然用相同的測(cè)序平臺(tái)處理測(cè)試樣品和參照組時(shí)所 獲得的結(jié)果最佳，但是當(dāng)用于測(cè)試樣品的平臺(tái)和用于參照組的不同時(shí)，結(jié)果也是有用的和 有差別的?？傊褂冒雽?dǎo)體技術(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明的游離DNA的大小選擇提供 了更穩(wěn)健的測(cè)定。該實(shí)施例還證實(shí)了大小選擇過(guò)程所帶來(lái)的優(yōu)點(diǎn)不依賴大規(guī)模平行測(cè)序平 臺(tái)的類型。
[0392]參考文獻(xiàn)
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[0401]表
[0402]
[0403] CN105074004A 1兄明干i 28/40 頁(yè)
[0404] 表1:通過(guò)柱提取和苯酚/氯仿提取獲得的DNA量的比較
[0405]
[0407] 表 1 (續(xù)）
[0408]
[0409] 表1 (結(jié)束）
[0410]
[0411] 表2 :通過(guò)柱提取獲得的文庫(kù)和通過(guò)苯酚/氯仿提取獲得的文庫(kù)之間在峰值處的DNA分?jǐn)?shù)的比較
[0412]
[0413] 表 2(續(xù)）
[0414]
[0415] 表3 :由通過(guò)預(yù)測(cè)序30個(gè)文庫(kù)獲得的總共20000個(gè)序列數(shù)來(lái)映射的唯一精確序列 的數(shù)量
[0416] CN 105074004 A IXm -f} 34/40頁(yè)
[0417]
[0418] 表4 :91個(gè)樣品的NGS測(cè)序結(jié)果
[0419]
[0420]
[0421] 表 4(續(xù)）
[0422]
[0423]
[0424] 表4 (結(jié)束）
[0425]
[0426]
[0427] 表5 :圖2至13中所示的特定樣品的染色體核型
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 從包含游離DNA的母體生物樣品中獲得用于診斷胎兒非整倍性的一組參照樣品和/ 或一組參照參數(shù)的方法，所述方法包括： -從獲自懷有整倍體胎兒的整倍體孕婦的一組生物樣品中提取游離DNA ; _在所述提取步驟之后，分析每個(gè)樣品內(nèi)DNA分子的大小分布并基于所述樣品內(nèi)DNA分 子的大小分布選擇一組樣品； -對(duì)每個(gè)經(jīng)大小選擇的樣品的DNA進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序； _將每個(gè)樣品所獲得的序列映射到人類基因組上； _計(jì)算一組參照參數(shù)，其中每個(gè)參照參數(shù)指示每個(gè)樣品映射到目的染色體或染色體區(qū) 域的唯一精確序列的數(shù)量； -獲得一組參照樣品和/或一組參照參數(shù)。2. 權(quán)利要求1的方法，其包括： (i) 從獲自一組懷有整倍體胎兒的整倍體孕婦的一組生物樣品中提取游離DNA ; (ii) 分析每個(gè)樣品內(nèi)DNA分子的大小分布； (iii) 基于所述樣品內(nèi)DNA分子的大小分布選擇第一組樣品； (iv) 對(duì)來(lái)自所述第一組樣品的每個(gè)樣品的DNA進(jìn)行預(yù)測(cè)序； (V)將步驟（iv)中得到的序列映射到人類基因組上； (vi) 基于步驟（V)中映射到人類基因組上的唯一精確序列的數(shù)量選擇第二組樣品； (vii) 對(duì)來(lái)自所述第二組樣品的每個(gè)樣品的DNA進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序； (viii) 將步驟（vii)中得到的序列映射到人類基因組上； (ix) 基于步驟（viii)中映射到人類基因組上的唯一精確序列的數(shù)量選擇一組參照樣 品。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中從所述生物樣品組的每個(gè)樣品中提取游離DNA包括： -將所述生物樣品與含有氯仿和苯酚的組合物混合； -從所述混合物中萃取水相； -從所述水相中沉淀DNA。4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中基于DNA分子的大小分布選擇一組樣品的步 驟包括從樣品中去除大小大于200bp的DNA分子的步驟。5. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中基于所述樣品內(nèi)DNA分子的大小分布選擇一 組樣品的步驟包括選擇其中至少90wt %，優(yōu)選95wt %以上的DNA分子的大小小于200bp、優(yōu) 選為156bp至176bp的樣品。6. 權(quán)利要求1至3的方法，其中基于所述樣品內(nèi)DNA分子的大小分布選擇一組樣品的 步驟包括選擇至少0. 88ng/ y L的DNA分子大小小于200bp、優(yōu)選156bp至176bp的樣品。7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中大小選擇在制備測(cè)序文庫(kù)之前進(jìn)行。8. 權(quán)利要求1的方法，其中參照樣品組包括具有1000萬(wàn)個(gè)以上的唯一精確序列讀長(zhǎng)的 樣品。9. 權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟（vi)包括選擇具有相對(duì)于在步驟（iv) 中得到的序列總數(shù)的至少70%的唯一精確序列的樣品。10. 權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟（vii)包括對(duì)每個(gè)樣品的至少2500萬(wàn) 個(gè)序列進(jìn)行測(cè)序。11. 權(quán)利要求2至6、8或9中任一項(xiàng)的方法，其中步驟（ix)包括選擇具有1500萬(wàn)以上 個(gè)的唯一精確序列讀長(zhǎng)的樣品。12. 權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中，從其中提取游離DNA的生物樣品組還包括 獲自懷有非整倍體胎兒的整倍體孕婦的樣品。13. 從母體生物測(cè)試樣品診斷胎兒非整倍性的方法，其包括： (a) 從獲自孕婦的母體生物測(cè)試樣品中提取游離DNA ; (b) 對(duì)提取自所述測(cè)試樣品的游離DNA進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序； (c) 將步驟（b)中獲得的序列映射到人類基因組上； (d) 計(jì)算指示映射到目的染色體或染色體區(qū)段區(qū)域上的唯一精確序列的數(shù)量的測(cè)試參 數(shù)； (e) 計(jì)算一組參照參數(shù)，其中每個(gè)參照參數(shù)指示如權(quán)利要求1至11中獲得的一組參照 樣品的樣品映射到目的染色體或染色體區(qū)域上的唯一精確序列的數(shù)量； (f) 將步驟（d)中計(jì)算的所述測(cè)試參數(shù)與步驟（e)中計(jì)算的所述參照參數(shù)組進(jìn)行比 較； (g) 基于所述比較，診斷胎兒非整倍性。14. 權(quán)利要求13的方法，其中，在所述提取步驟之后，進(jìn)行基于所述樣品內(nèi)DNA分子的 大小分布的大小選擇步驟。15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述大小選擇在制備測(cè)序文庫(kù)之前進(jìn)行。16. 權(quán)利要求14或15的方法，其中大小選擇包括從樣品中去除大小大于200bp的DNA 分子的步驟。17. 權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述從母體生物測(cè)試樣品中提取游離DNA 包括： -將所述生物樣品與含有氯仿和苯酚的組合物混合； -從所述混合物中萃取水相； -從所述水相中沉淀DNA。18. 權(quán)利要求13的方法，其中所述測(cè)試參數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)化為所有常染色體的中位唯一精確 序列標(biāo)簽密度的目的染色體或染色體區(qū)域的唯一序列標(biāo)簽密度。19. 權(quán)利要求13的方法，其中所述步驟（f)中的比較通過(guò)計(jì)算所述測(cè)試參數(shù)相對(duì)于參 照參數(shù)組的z分?jǐn)?shù)來(lái)進(jìn)行。20. 權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試參數(shù)是目的染色體或染色體區(qū)域 的絕對(duì)精確序列計(jì)數(shù)或目的染色體或染色體區(qū)域的平均精確序列計(jì)數(shù)。21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述步驟（f)中的比較通過(guò)計(jì)算目的染色體或染色體區(qū) 域的唯一精確序列計(jì)數(shù)、或目的染色體或染色體區(qū)域的平均精確序列計(jì)數(shù)屬于參照組的目 的染色體的唯一精確序列計(jì)數(shù)的正態(tài)分布的概率來(lái)進(jìn)行。22. 權(quán)利要求13至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述目的染色體是21號(hào)染色體、16號(hào)染 色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體或11號(hào)染色體。23. 從包含胎兒和母體的游離DNA的母體生物樣品中提取游離DNA的方法，其包括： -將所述生物樣品與含有氯仿和苯酚的組合物混合； -從所述混合物中萃取水相； -從所述水相中沉淀DNA。24. 診斷胎兒非整倍性的試劑盒，其包括： _根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法可獲得的一組參照樣品； -和/或一組參照參數(shù)，其中每個(gè)參照參數(shù)指示根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法 可獲得的參照組的樣品映射到目的染色體或染色體區(qū)域上的唯一精確序列的數(shù)量，其任選 包括在物理載體中。25. 權(quán)利要求24的試劑盒，其還包括如下中的至少一個(gè)： -用于提取游離DNA的一種或多種組合物和/或試劑盒，包括含有苯酚和氯仿的組合 物； -計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其用于實(shí)施從母體生物樣品中獲得用于診斷胎兒非整倍性的一組 參照樣品的方法中的一個(gè)或多個(gè)步驟； -計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其用于實(shí)施從母體生物測(cè)試樣品診斷胎兒非整倍性的方法中的一 個(gè)或多個(gè)步驟。
【專利摘要】本發(fā)明涉及從包含游離DNA的母體生物樣品獲得用于診斷胎兒非整倍性的一組參照樣品和/或一組參照參數(shù)的方法，所述方法包括：-從獲自懷有整倍體胎兒的整倍體孕婦的一組生物樣品中提取游離DNA；-在所述提取步驟之后，分析每個(gè)樣品內(nèi)DNA分子的大小分布并基于所述樣品內(nèi)DNA分子的大小分布選擇一組樣品；-對(duì)每個(gè)經(jīng)大小選擇的樣品的DNA進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序；-將每個(gè)樣品所獲得的序列映射到人類基因組上；-計(jì)算一組參照參數(shù)，其中每個(gè)參照參數(shù)指示每個(gè)樣品映射到目的染色體或染色體區(qū)域上的唯一精確序列的數(shù)量；-獲得一組參照樣品和/或一組參照參數(shù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105074004
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380068714
【發(fā)明人】M·奧思特萊斯, C·德呂昂薩格納, N·文森特, B·康拉德
【申請(qǐng)人】吉恩斯寶特公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2013年10月31日
【公告號(hào)】CA2888906A1, EP2728014A1, EP2728014B1, EP2914738A1, US20150275290, WO2014068075A1