于現(xiàn)有技術(shù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)。
[0303] 在第二方法中，可使用基于概率的計算進行所述比較，優(yōu)選使用同時包括整倍體 和非整倍體（三倍體）樣品的參照組。根據(jù)該方法，所述過程同樣包括兩個步驟。第一步 包括將獲自測試樣品的序列在參照人類基因組上比對，第二步包括將所獲得的測試樣品的 每條染色體的結(jié)果與所獲得的參照組樣品的相應(yīng)染色體的結(jié)果進行比較：
[0304] -將獲自具有經(jīng)驗證的三體的一組樣品中的給定染色體的UES計數(shù)的值連同獲自 一組正常參照樣品的相同的給定染色體的UES計數(shù)的值表示在圖中；
[0305] -使用正常的參照組樣品確定值的區(qū)間，就概率而言，應(yīng)該只有千分之一的正常樣 品超過該區(qū)間。將該區(qū)間在圖上示出。因此，每條染色體建立了一副"參照圖"；
[0306] -然后，將獲自測試樣品的給定染色體的UES計數(shù)的值也標(biāo)示在相應(yīng)的充當(dāng)臨床 評估基準(zhǔn)的參照圖上。一直將多個參照組（例如至少四個及優(yōu)選六個參照組（例如圖17 至38所示的參照組N1、N2、B1、B2、A1和A2)--其每組包含至少50及優(yōu)選至少75個參照 樣品）用于建立診斷，由此提供了對所述診斷的確認(rèn)。
[0307] 實施例
[0308] 實施例1
[0309] 從母體血液中提取DNA以及質(zhì)量控制實驗
[0310] 在等待當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)的前瞻性臨床研究的情況下，收集了 100名孕婦的血 液樣品。所述母親的孕齡是14. 63 ±4. 00周。
[0311] 有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷30分鐘后收集兩支7. 5ml管（BDVacutainer米血管，Beckton Dickinson，NJUSA07417 或BCT-管，Streck，Inc.，Omaha，NE68128)。血漿根據(jù)所述純 化（Chiuetal2008;Fanetal2008)，并立即冷凍于-20°C。將2ml血漿等份試樣用于 使用如下的nucleospin血衆(zhòng)試劑盒（MacherelyNagel，根據(jù)如下所述的制造商的說明書） 或使用如下的苯酚-氯仿法提取游離DNA:
[0312]nucleospin血衆(zhòng)試劑盒（根據(jù)制造商的說明書）
[0313] 將20y1蛋白酶K加入到2ml血漿等份試樣中，并將混合物在37°C下加熱10分鐘 (不攪拌）。將所述血漿-蛋白酶K混合物轉(zhuǎn)移至5ml管中，然后加入緩沖液BB(1. 5X的血 漿體積），將管翻轉(zhuǎn)混合3次并渦旋振蕩3秒。將混合物上樣于幾個柱子上（600y1/柱） 并以2000g(320rpm)離心30秒，然后以11000g(9600rpm)離心5秒。然后第一次用500y1 緩沖液WB對柱子進行洗滌并以11000g(9600rpm)離心30秒，第二次用250y1緩沖液WB 洗滌并以1l〇〇〇g(9600rpm)離心3分鐘。最后，將20y1洗脫緩沖液加入柱中，然后將其以 11000g(9600rpm)離心30秒。將所得的DNA提取物在單個的2ml管中混合。
[0314] 苯酚-氯仿法
[0315]加入 200yl10%SDS、40yl0.5MEDTA和 25yl蛋白酶K，并將樣品在 58°C下孵 育2小時。加入2mLRT平衡的生物苯酚，并攪拌樣品，將其以4000rpm離心10分鐘。將水 相（1800ml)轉(zhuǎn)移到新的5mL管中，用20y1糖原/GlycoBlue、1/9體積的3MNaAc和0. 7 體積的冰冷的異丙醇沉淀DNA。在劇烈渦旋振蕩后，轉(zhuǎn)移2ml到新管中并在微量離心機中以 最大速度離心10分鐘。緩慢倒出上清液，加入剩余體積，并將管在相同條件下離心。將DNA 沉淀物首先用600y1 70%的乙醇洗滌，然后用600y1乙醚洗滌，并懸浮在20y1 0. 5mM TrispH8. 2 中。
[0316] 用PicoGreen測量DNA濃度，并在對應(yīng)于男性胎兒的樣品上進行TH01和SRY的 qPCR測定。這些測定的原理是為了對如下進行定量：
[0317]-男性DNA，即胎兒DNA，通過擴增存在于人類Y染色體上的SRY基因的137bp序 列；
[0318]-總?cè)祟怐NA，即胎兒+母體DNA，通過擴增存在于人類11號染色體上的包含 TH01STR(短串聯(lián)重復(fù)）的162bp序列。
[0319] 將小鼠基因GALT用作內(nèi)部對照。簡單地說，為每個樣品制備主混合物（master mix)，其包含 12. 5y1AbsoluteQPCRMix(AB-1133/A，ABGene)、2. 5y1 引物 / 探針混合物 SRY/TH01/GALT和 0? 4y1 5U/y1 的AmpliTagGold(N8080249，AppliedBiosystems)。制 備25y1PCR混合物，各包含：5y1溶于水的待擴增的DNA樣品、5y1 10拷貝/y1的Std Galt(GALT的標(biāo)準(zhǔn)序列）、15y1主混合物。
[0320] 每個系列都包括標(biāo)準(zhǔn)品（10y1標(biāo)準(zhǔn)品、200個細(xì)胞/10y1)。在RotorGeneqPCR 儀器（Qiagen)上運行 50 個RT-PCR循環(huán)（95°C/15"；60°C/60"），在通道SRY(綠色）、 TH01 (黃色）、GALT(紅色）上于60°C下收集。
[0321] 表1示出了使用兩種方法一一基于柱和基于苯酚的方法一一平行提取的來自懷有 男性胎兒的孕婦的九個血漿樣品的比較結(jié)果?？梢钥闯觯诒椒拥奶崛〉漠a(chǎn)量明顯更高 (p= 2. 2 ? 10 5)，并且基于苯酚的方法產(chǎn)生約五倍多的DNA，最重要的是產(chǎn)生更一致且更穩(wěn) 健的SRY(即胎兒DNA)的信號（p〈0. 05)。在表1中，以"細(xì)胞/y1"計的值是參照所述標(biāo) 準(zhǔn)品進行計算的，并且是指基于6pg基因組DNA/細(xì)胞的假設(shè)，就細(xì)胞數(shù)量而言的基因組DNA 量的等價物。
[0322]實施例2
[0323] 基于染色質(zhì)-免痔沉淀（ChIP)的鳥槍法測序NGS方案
[0324] 方法
[0325] 根據(jù)說明書進行ChIP測序方案（lllumina)。將20ng游離DNA用于文庫構(gòu)建。將 相當(dāng)于總文庫體積的1/15的1y1的各文庫在2100Bioanalyzer(Agilent)上運行用于分 析大小分布和測定峰濃度。將每五個文庫在MiSeqdllumina)上進行預(yù)測序。根據(jù)說明書 (lllumina)使用TruSeqSBSv3試劑盒，將文庫以50bp的單個讀長和50+7個循環(huán)在HiSeq 2000(lllumina)上進行測序，從而得到30 ? 106個讀長/樣品。
[0326] 如上所述，對50個樣品平行進行兩種提取方案（柱提取和苯酚/氯仿提?。Ｊ?余的樣品僅通過苯酚/氯仿法提取。
[0327] 結(jié)果
[0328] 對游離DNA的大小測定表明：在減去接頭/條形碼序列大小之后，峰值大小幾乎完 全在所預(yù)測的166bp的大小以內(nèi)（圖1;Loetal，2010)。所分析的所有91個樣品的峰值 大小分布是均勻的，僅有l(wèi)_2bp的變化。在右側(cè)圖中可見的較小大小的肩峰很可能反映的 是峰值大小為133-143bp的胎兒DNA。
[0329] 苯酚/氯仿提取方案產(chǎn)生了更高濃度的大小在166bp峰值附近的DNA分子，柱文 庫和苯酚/氯仿文庫之間具有統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異（P〈l〇25;表2,顯示了大小范圍為156bp 至176bp的DNA分子的部分的濃度，每種提取方法測量50個文庫）。
[0330] 30個預(yù)測序文庫（表3)和91個樣品的最終輸出序列（表4和圖2)的唯一精確 序列在過濾后讀長的75-80%之間。
[0331] 總之，UES的中位數(shù)多于2000萬，這比在所公布的非整倍性測試中用作基準(zhǔn)的各 自數(shù)量多出四倍以上（Fanetal.，2008、Chiuetal.，2008、Stummetal.，2012)。
[0332] 將每條染色體分割為50kb區(qū)段，對于每個區(qū)段，計數(shù)映射到所述區(qū)段上的UES的 數(shù)量。計算每條染色體的每個區(qū)段的UES計數(shù)的中位值，從而得到所有常染色體的序列標(biāo) 簽密度。
[0333] 將21號染色體的序列標(biāo)簽密度標(biāo)準(zhǔn)化為所有常染色體的序列標(biāo)簽密度的中位 值，從而得到21號染色體的標(biāo)準(zhǔn)化的序列標(biāo)簽密度，如圖4中所有91個整倍體和非整倍體 樣品所示。該值指示由21號染色體產(chǎn)生的胎兒和母體DNA片段的分?jǐn)?shù)。
[0334] 將具有正常染色體核型的樣品用于構(gòu)建提供基準(zhǔn)以標(biāo)準(zhǔn)化單個染色體計數(shù)的參 照組。使用這樣的參照組，本發(fā)明的診斷方法能夠使用4. 4的z分?jǐn)?shù)完美地區(qū)分21三體病 例和非21三體病例（圖3)。
[0335] 以類似的方式，將18號染色體的序列標(biāo)簽密度標(biāo)準(zhǔn)化為所有常染色體的序列標(biāo) 簽密度的中位值，從而得到標(biāo)準(zhǔn)化的序列標(biāo)簽密度，如圖5中本研究所分析的所有91個整 倍體和非整倍體樣品所示。
[0336] 從圖5中可清楚地看出，使用相同的66個整倍體樣品的參照組，本發(fā)明的診斷方 法也能夠使用4. 4的z分?jǐn)?shù)區(qū)分18三體病例和非18三體病例。
[0337] 總之，本發(fā)明的方法使得能夠進行比第一代實驗（Chiuetal2008、Fanetal 2008、Stummetal2012)高出約兩個數(shù)量級的更嚴(yán)格的區(qū)分，其偶然產(chǎn)生錯誤結(jié)果的先驗 概率彡1. 1 ? 10 5。
[0338] 最后，將另一種算法用于處理獲自91個樣品的數(shù)據(jù)。結(jié)果示于表6至13。通過使 用該第二種算法和根據(jù)本發(fā)明方法選擇的一組參照樣品，所述診斷方法使得能夠?qū)?1三 體樣品、13三體樣品、18三體樣品、22三體樣品、4p微缺失樣品、5p微缺失-復(fù)制樣品與整 倍體樣品區(qū)別開，其偶然產(chǎn)生錯誤結(jié)果的先驗概率< 1. 1 ? 10 n。
[0339] 實施例3 :游離DNA的大小詵擇
[0340] 先前的研究已表明存在于血液中的游離胎兒DNA小于200bp，平均在150bp左右。
[0341] 從確定量的血液中提取的DNA的量可以是可變的，從幾納克到微克以上（平均在 10-50ng/2mL血漿之間）。對DNA的分析已表明該變化主要由存在或不存在來自母體的很 可能是細(xì)胞裂解產(chǎn)物的大DNA片段（彡lkb)而引起。
[0342] 本發(fā)明人設(shè)計了方案以從所提取的游離DNA樣品中去除大DNA片段，從而"富集" 包含胎兒DNA的小DNA片段（小于或等于200bp)，由此提高無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷測試的質(zhì)量。 在任何進一步處理（如制備測序文庫）之前，對粗制的DNA提取物進行大小選擇的步驟。
[0343] 將磁珠（AMPure.⑩BeckmanCoulter)用于大小選擇。根據(jù)該技術(shù)，DNA片段 結(jié)合到磁珠上，然后通過應(yīng)用磁場從污染物中分離。將所結(jié)合的DNA用乙醇洗滌然后將其 從磁顆粒上洗脫下來。
[0344] 實驗與結(jié)果
[0345] 通過BioanalyzerHighSensitivity分析若干粗提取的游離DNA樣品以檢測它們 的大小分布。三種粗制的DNA提取物（名為GWX-351、GWX-352和GWX-353)的DNA大小分 布的實例示于圖16A中（左側(cè)圖）。
[0346]對于純化（大小選擇），從樣品GWX-351、-352和-353中制備20y1的DNA溶液 (10ng)。加入10ylAMPure珠，將樣品在室溫下孵育幾分鐘。然后在磁力架上將小珠從混 合物中分離出來，并將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。
[0347] 對小珠進行進一步的分離循環(huán)。在最后一輪純化之后，將小珠用200y1新鮮的 80%的乙醇洗滌兩次，而不重懸小珠。然后將小珠干燥10分鐘，并重懸于10y1EB緩沖液。
[0348] 圖16B(右側(cè)圖）示出了在用AMPure珠連續(xù)循環(huán)純化之后，通過Bioanalyzer對 樣品GWX-351、-352和-353進行分析所得到的結(jié)果。通過純化過程去除大分子量的峰，保 留150-200bp的較低分子量的峰。獲得了與其他樣品的對比結(jié)果。所述結(jié)果證明使用小珠 可除去高分子量部分，產(chǎn)生大小約為200bp和更小的部分。
[0349] 實施例4 :經(jīng)大小詵擇的游離DNA樣品的非整倍件檢測（1)
[0350]a)DNA提取
[0351] 從48名孕婦處收集血液樣品并如實施例1所述使用苯酚-氯仿法提取游離DNA。
[0352]b)富集大小小于200bo的游離DNA片段：大小詵擇
[0353] 如實施例3所述將經(jīng)血液提取的游離DNA在磁珠（AMPureXP?,Beckman Coulter)上進行連續(xù)的大小選擇步驟。部分樣品不進行大小選擇步驟以使得能夠比較有和 沒有大小選擇的非整倍性檢測實驗的靈敏度。
[0354] c) f庫制備（用于通討邊合成邊測序摶術(shù)講行的大規(guī)樽平行測序）
[0355] i)末端修復(fù)
[0356] 這個步驟使用末端修復(fù)混合物將由dsDNA的片段化所產(chǎn)生的突出端轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥?端。此混合物的3'至5'核酸外切酶活性去除3'突出端，并且聚合酶活性補平5'突出端。
[0357] 將20y1末端修復(fù)混合物（ERP)加入到含樣品DNA的板的各孔中，將混合物充分 混合并短暫離心。然后按照制造商的說明書將板在熱循環(huán)儀上孵育。
[0358] 將樣品從熱循環(huán)儀中移出并進行純化步驟。
[0359]ii)添加腺苷酸3'末端
[0360] 將單個'A'核苷酸加至平端dsDNA片段的3'末端，以防止其在接頭連接反應(yīng)中彼 此連接，并為隨后將接頭連接至片段提供互補的突出端，所述接頭在其3'末端具有相應(yīng)的 單個'T'核苷酸。該策略確保了低比率的嵌合體（拼接的模板）形成。
[0361] 將12.5iiLA加尾混合物（ATL)加入到含平端DNA片段的板的各孔中。混合并短 暫離心之后，按照制造商的說明書將板在熱循環(huán)儀上孵育。
[0362]iii)連接接頭
[0363] 在添加腺苷酸3'末端之后，立即將成對的末端接頭（如由lllumina商業(yè)化的那 些）--其允許PCR擴增--連接至dsDNA的末端。
[0364] 將5y1接頭預(yù)混合物加入到A加尾板的各孔中，然后加入2. 5y1連接混合物。將 板短暫離心并根據(jù)制造商的說明書在熱循環(huán)儀上孵育。然后將5y1終止連接緩沖液加至 各孔中以使連接終止。然后進行純化步驟。
[0365]iv)富集DNA片段
[0366] 本過程的這個步驟使用PCR以選擇性地富集那些在兩個末端都有接頭分子的DNA 片段，同時將特異性的VINCI索引（index)加至各樣品并完成接頭序列以允許隨后在流動 池上進行雜交。沒有接頭的片段不能與流動池中的和表面結(jié)合的引物雜交，僅在一個末端 具有接頭的片段能與和表面結(jié)合的引物雜交但不能形成簇。
[0367] 將34y1PCR預(yù)混合物加入到PCR板的各孔中，然后加入1y1解凍的PCRP7-索 引引物（25yM)。將15y1樣品轉(zhuǎn)移到PCR板的各孔中，并在樣品板的空孔內(nèi)加入15y1水 作為陰性對照。
[0368] 使用下列PCR程序?qū)逶跓嵫h(huán)儀上孵育：
[0369] 98°C30 秒
[0370] 15個如下的循環(huán)：
[0371] 98°C10 秒
[0372] 65°C30 秒
[0373] 72°C30 秒
[0374] 72°C5 分鐘
[0375] 在10 °C下保持
[0376] 所述擴增產(chǎn)生了以約280bp為中心的彌散（條帶）。將在約120bp產(chǎn)生條帶的任 何空接頭通過隨后的AMPure純化步驟去除。
[0377] d)大規(guī)樽平行測序和映射
[0378] 如實施例2所述在HiSeq2000(lllumina)上對文庫進行測序，并映射到人類基因 組上。
[0379] e)結(jié)果
[0380] 使用概率表測定每個測試樣品的每條常染色體的唯一精確序列（UES也稱為UEM) 計數(shù)，并將其與第一參照組的每個樣品的相應(yīng)染色體的值進行比較。對其他五個參照組重 復(fù)此操作，得到總共六個參照組（名為Al、A2、Bl、B2、Nl、N2)。所述參照組都包括經(jīng)驗證 的整倍體和三倍體樣品并按照如上文所述的包括大小選擇< 200bp的DNA分子的步驟的本 發(fā)明方法來獲得。參照組A1和A2包括總共267個樣品；組N1和N2包括總共167個樣品； 組B1和B2包括總共100個樣品。
[0381] 具體地，將獲自第一組參照樣品（例如參照組N1) -一其具有經(jīng)驗證的三體性和 經(jīng)驗證的整倍性一一中的給定的染色體的UES計數(shù)的值在圖上標(biāo)繪出。將參照組的正常 (整倍體）樣品用于確定值的區(qū)間，就概率而言，應(yīng)該只有千分之一的正常樣品超過該區(qū) 間。在圖上示出該區(qū)間。
[0382] 以這種方式，建立了一幅"參照圖"/染色體/參照組（即六幅參照圖/染色體）。 參照組A1的13、16、18和21號染色體的"參照圖"可分別參見圖39a至39b(灰色點）。還 示出了概率區(qū)間。參照組N1的13、16、18和21號染色體的類似的參照圖可分別