D
[0031]穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：BIO-RAD power PAC 3〇0
[0032]凝膠成像系統(tǒng)：Alphalmage Multimage Light Cabinet
[0033] 電子天平、培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌器、搖床以及一些常用的實驗設備。
[0034] 本發(fā)明的1%瓊脂凝膠的制備方法如下：
[0035] 用天平稱取0.3g瓊脂糖，倒入30ml的1XTAE緩沖液中，搖勻后置于微波爐中加 熱至完全溶解，取出待稍涼后（防止高溫使EB揮發(fā)），加入EB 2 y L。將制膠板（Bio-Rad公 司）放置于水平位置，然后插入樣品梳子。將之前配制的瓊脂糖凝膠倒入制膠板內(nèi)槽。冷 卻半小時待凝膠凝固后取出梳子，將凝膠放入電泳槽（Bio-Rad公司）內(nèi)并加入1XTAE電 泳緩沖液使其浸沒凝膠。在點樣板上點上1/5體積的點樣緩沖液（溴酚藍）。
[0036] 實施例1
[0037] 施氏舞種質(zhì)分子標記鑒定方法，以施氏舞、達氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞 舞、小體舞和達氏鰉作為研究對象，包括以下步驟：
[0038] (I)分別取施氏舞、達氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞和達烏爾鰉 樣本，采用海洋組織DNA提取試劑盒（Tiangen公司）提取基因組DNA。
[0039] 然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA:
[0040] 制備1 %的瓊脂糖凝膠，并將2 y L DNA溶液加入點樣緩沖液并混勻上樣電泳。 100V電壓電泳25min。電泳后根據(jù)紫外透射檢測儀上電泳帶的亮度來確定模板DNA的濃度， 并相應稀釋模板，使DNA模板的濃度最終約為100ng/ y L。
[0041] ( II )分別以施氏舞、達氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞和達烏爾鰉 樣本的基因組DNA為模板，在特定引物的引導下進行PCR擴增。
[0042] (l)PCR 擴增
[0043] PCR擴增施氏舞、達氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞和達烏爾鰉的 fzd8基因片段。fzd8引物參考西伯利亞舞A. baerii的fzd8序列（GenBank號：AY333968)， 應用引物設計軟件Primer 5. 0設計：
[0044] fzd8-F :5' -TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ IDN0:8)和 fzd8-R :5' -CTGAATAAA GACACGAACCC-3'（SEQIDN0:9)，由 Invitrogen 公司合成。
[0045] fzd8_F和fzd8_R為擴增fzd8目的片段的引物對，其中的F代表上游引物（或正 向引物），R代表下游引物（或反向引物）。下文引物的F/R與之相同。
[0046] 反應體系為25 y L，將各組分按以下順序依次在0. 2mL的PCR管中混合：
[0047]
[0048] 擴增步驟為：
[0049]
[0050] (2) PCR產(chǎn)物檢測與測序
[0051] 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，取檢測良好的樣本送Invitrogen公司測 序。
[0052] 測序驗證其序列信息，發(fā)現(xiàn)施氏舞的fzd8基因片段與其他種類的舞形目魚類的 fzd8序列存在差異，進行后期鑒定實驗。
[0053] (III)數(shù)據(jù)分析
[0054] 采用MEGA 5. 0對舞魚樣本的fzd8的測序結(jié)果分別進行比對和對齊，得到707bp 的fzd8序列，施氏舞在fzd8序列的第299位堿基為C，而達氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利 亞舞、小體舞和達烏爾鰉fzd8基因片段在該位點為T。
[0055] 上述實驗結(jié)果顯示：本發(fā)明的施氏舞的fzd8基因片段序列及SNP標記在GenBank 中都未見報道。
[0056] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
[0057]
[0058]
[0059] CN105063192Ah/l 丫/12 貝
[0060]
[0061]
[0062
[0063]
[0064]
【主權項】
1. 一種用于鑒定施氏舞種質(zhì)的分子標記，其為以待測舞科魚類基因組DNA為模板，通 過特異性引物PCR擴增獲得的fzd8基因片段，所述特異性引物的核苷酸序列為： 正向引物：5' -TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ ID N0:8)， 反向引物：5' -CTGAATAAAGACACGAACCC-3'（SEQ ID N0:9); 上述擴增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為C或T ; 優(yōu)選地，所述待測舞科魚類為施氏舞、達氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞 和/或達烏爾鰉。 2. fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為： 正向引物：5' -TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ ID N0:8)， 反向引物：5' -CTGAATAAAGACACGAACCC-3'（SEQ ID N0:9)。3. 根據(jù)權利要求1所述的分子標記或根據(jù)權利要求2所述的特異性引物在鑒定施氏舞 種質(zhì)中的應用。4. 施氏舞種質(zhì)的鑒定方法，其特征在于： (1) 從待測舞科魚類樣本中提取基因組DNA ; (2) 以待測舞科魚類基因組DNA為模板，利用權利要求2所述的特異性引物PCR擴增 fzd8基因片段； (3) 檢測擴增獲得的fzd8基因片段并測序，經(jīng)序列比對直接鑒定； 其中擴增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為C時，樣本為施氏舞或其產(chǎn) 品；擴增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為T時，樣本為其他舞魚或其產(chǎn)品。5. 根據(jù)權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于：所述的其它舞魚為達氏舞、中華舞、 俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞和達烏爾鰉中的任意一種或者多種。6. 根據(jù)權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于：擴增出的施氏舞、達氏舞、中華舞、 俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞或達烏爾鰉的fzd8基因片段，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7。7. 根據(jù)權利要求4-6任一項所述的鑒定方法，其中施氏舞產(chǎn)品或其他舞魚產(chǎn)品包括魚 子醬、熏制品、罐頭和/或皮制品。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于鑒定施氏鱘種質(zhì)的分子標記及利用該分子標記鑒定施氏鱘種質(zhì)的方法。利用特異性引物PCR擴增后獲得的fzd8基因片段在施氏鱘與其它鱘魚之間存在的種間序列差異，經(jīng)序列比對直接鑒定出施氏鱘或其產(chǎn)品。本發(fā)明在鱘科魚類中篩選fzd8核基因片段上SNP位點進行分析鑒定，具有實驗準確，鑒定可靠快捷，操作簡便等優(yōu)點。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105063192
【申請?zhí)枴緾N201510462600
【發(fā)明人】李久煊, 楊坤, 劉東奇, 宋昭彬, 代偉, 荊慧芳, 陳永柏, 李翀, 劉勇
【申請人】中國長江三峽集團公司, 四川大學
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月31日