一種抗菌肽pd22的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多臺(tái)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗菌肽ro22。
【背景技術(shù)】
[0002] 為了提高母豬繁殖效率和減少母源性疾病的垂直傳播，我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬一般選擇 3-4周齡斷奶，而斷奶過(guò)程在自然界中一般發(fā)生在3-4個(gè)月。仔豬早期斷奶給仔豬造成了巨 大的應(yīng)激，仔豬和母豬分開(kāi)、營(yíng)養(yǎng)來(lái)源從液態(tài)的母乳變?yōu)楣虘B(tài)的飼料、混群和環(huán)境的變化， 且早期斷奶仔豬消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育并不完善，極容易受各種病原菌的攻擊而感染疾 病，其中消化道疾病是最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的疾病之一，也是導(dǎo)致斷奶仔豬生長(zhǎng)抑制甚至死亡的 重要原因。長(zhǎng)期以來(lái)，使用抗生素是預(yù)防和治療斷奶仔豬腹瀉的主要手段，但是抗生素的大 量使用導(dǎo)致病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)、抗生素使用效果不斷削弱，且生豬生產(chǎn)中抗生素的長(zhǎng) 期大量使用導(dǎo)致的畜產(chǎn)品藥物殘留和有害菌種耐藥性增強(qiáng)已經(jīng)成為威脅人類(lèi)安全的重大 隱患。因此，尋找能夠替代抗生素解決斷奶仔豬腸道疾病問(wèn)題的產(chǎn)品是當(dāng)前動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究 中的熱點(diǎn)課題?？咕氖亲匀唤缟镏袕V泛存在的小分子活性多肽，具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定 性強(qiáng)和不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等特點(diǎn)，是替代抗生素理想的潛在物質(zhì)。然而，天然來(lái)源的抗菌 肽大多具有分子量大、抗菌活性不高、對(duì)宿主細(xì)胞具有毒副作用或能導(dǎo)致宿主溶血等缺陷， 在一定程度上限制了抗菌肽在斷奶仔豬養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用。通過(guò)分子設(shè)計(jì)和改造是克服天 然來(lái)源抗菌肽缺陷、促進(jìn)抗菌肽在斷奶仔豬養(yǎng)殖中應(yīng)用的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的抗菌肽。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種抗菌肽TO22,其特征在于：所述抗菌肽TO22的 氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。具體為：KKIVKAALQAATQ，分子量為1369. 67Da，等電點(diǎn)為 10. 30〇
[0005] 上述抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：
[0006] 1)抗菌肽的化學(xué)合成方法：按SEQ ID NO :1所示氨基酸序列，用全自動(dòng)多肽合成 儀（ABI433)合成抗菌肽全序列，并通過(guò)HPLC反相柱層析脫鹽純化；
[0007] 2)純化的抗菌肽分子量采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MLDI-TOF) 測(cè)定，等電點(diǎn)使用等電聚焦電泳測(cè)定，氨基酸序列采用自動(dòng)氨基酸序列測(cè)定儀進(jìn)行解析。
[0008] 本發(fā)明的抗菌肽在仔豬飼料中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中的抗菌肽TO22具有分子量小、人工合成方便且成 本低、對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和魏氏梭菌等細(xì)菌殺菌作用強(qiáng)、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在斷奶仔 豬飼料中應(yīng)用能夠顯著降低斷奶仔豬腹瀉率和提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)速度。
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)測(cè)定抗菌肽Η)22最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC)來(lái)反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃 度。結(jié)果表明本發(fā)明的抗菌肽TO22對(duì)大腸桿菌、魏氏梭菌、沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌均有 非常強(qiáng)的殺傷作用。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)上，即使在300ug/mL的濃度下，抗菌肽TO22對(duì)豬小腸 上皮細(xì)胞IPEC-I也存在很低（小于10%)的細(xì)胞毒副作用。與陰性對(duì)照相比，抗菌肽TO22 可顯著降低斷奶仔豬腹瀉率?？咕腜D22可顯著提高斷奶仔豬日增重和降低料重比，顯著 提高斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值，說(shuō)明抗菌肽TO22能夠 顯著改善斷奶仔豬腸道功能。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是抗菌肽ro22細(xì)胞毒性分析圖；
[0012] 圖2抗菌肽TO22對(duì)大腸桿菌攻毒斷奶仔豬（24日齡）腹瀉的影響圖；
[0013] 圖3抗菌肽TO22對(duì)24日齡斷奶仔豬腹瀉率的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。實(shí)施例中未注明 具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0015] 實(shí)施例1 :抗菌肽TO22的制備
[0016] 抗菌肽TO22的化學(xué)合成方法：根據(jù)
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述氨基酸序列，用全自動(dòng)多肽合 成儀（ABI433)合成TO22全序列（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院合成），并通過(guò)HPLC反相柱 層析脫鹽純化；
[0017] 純化的抗菌肽TO22分子量采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MLDI-TOF)測(cè)定，等電點(diǎn)使用等電聚焦電泳測(cè)定，氨基酸序列采用自動(dòng)氨基酸序列測(cè)定 儀進(jìn)行解析。
[0018] 抗菌肽TO22,所述的抗菌肽TO22為人工設(shè)計(jì)合成的活性多肽，包含13個(gè)氨基酸殘 基，分子量為1369. 67Da，等電點(diǎn)為10. 30,其氨基酸序列為KKIVKAALQAATQ(SEQ ID N0:1)。
[0019] 實(shí)施例2 :抗菌肽TO22抑菌實(shí)驗(yàn)
[0020] 通過(guò)測(cè)定抗菌肽]^22 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC) 來(lái)反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。采用二倍稀釋法， 具體方法如下：
[0021] 受試細(xì)菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，然后于37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出 后，用一次性接種環(huán)挑取各受試細(xì)菌單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)菌液0D600,根據(jù)10D600 = IX IO9CFlVmL將受試菌菌 液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至2 X 105CFU/mL。然后在無(wú)菌96孔板各孔中加入100 μ L LB液體 培養(yǎng)基，然后在Al孔中加入100 μ L稀釋到一定濃度的抗菌肽TO22樣品（抗菌肽樣品加入 前用0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌），混勻后取100 μ L加入Α2孔，Α2孔混勻后再取100 μ L加 入A3孔，依次倍比稀釋?zhuān)詈髲摩?2孔吸出100 μ L棄去，至此抗菌肽TO22二倍濃度梯度樣 制成。向預(yù)先加入抗菌肽TO22的各孔中再依次加入已稀釋好的菌液100 μ L混勻，于37°C 緩慢震蕩培養(yǎng)16h，然后測(cè)定600nm處吸光值。結(jié)果計(jì)算：取檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的孔和與之 相鄰的有細(xì)菌生長(zhǎng)的孔中抗菌肽TO22濃度之和的平均值作為抗菌肽TO22最小抑菌濃度。 測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1所示。從表1中可以看出抗菌肽ro22對(duì)大腸桿菌、魏氏梭菌、沙門(mén)氏菌和 枯草芽孢桿菌（中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供）均有非常強(qiáng)的殺傷作用。