同時(shí)檢測(cè)xrcc1、ercc、gstp1和gstm1基因多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和 GSTM1基因多態(tài)性的引物與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉑類抗癌藥物，包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等，是目前臨床應(yīng)用中對(duì)多種癌癥具 有較高活性的抗癌藥物，主要通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷來(lái)清除癌細(xì)胞。
[0003]X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基團(tuán)1 (XRCC1)，位于人類染色體19ql3. 2-13. 3,大小為33 kb。 切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 (ERCC1)，為人類DNA損傷修復(fù)基因，位于染色體19ql3. 2-13. 3。切 除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因2 (ERCC2)，參與核苷酸切除修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄，在DNA損傷修復(fù)中起著 重要作用。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Pl(GSTPl)，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST)是體內(nèi)最重要的II相代 謝酶，通過(guò)直接結(jié)合化學(xué)致癌物或通過(guò)與谷胱甘肽結(jié)合而發(fā)揮解毒功能，可降解外源性化 合物毒性。GSTM1純合缺失（GSTMl_Loss)可導(dǎo)致酶活性喪失或降低，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)某些 毒物或致癌物的敏感性。
[0004] 現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示，XRCC1_R399Q R/R，R/Q和Q/Q基因型頻率分別約為55%，37%， 8% ;ERCC1_C118T C/C，C/T，T/T 基因型頻率分別約為 52. 6%，43. 1%，4. 2% ;ERCC2_L751Q K/ K，K/Q，Q/Q 基因型頻率分別約為 84. 92%，15. 08%，0% ;GSTP1_I105V Ile/Ile(I/I)，Ile/Val (I/V)，Val/Val (V/V)基因型頻率分別為57. 4%，35. 9%，6. 7%。此外，GSTM1基因多態(tài)性在 不同地區(qū)、不同種族的人群間有著不同的分布頻率，GSTMl_Loss基因型頻率在華人群體中 分布較高。
[0005] 因此，通過(guò)XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的檢測(cè)，有助于預(yù)測(cè)鉑 類藥物化療的預(yù)后，在幫助指導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方面具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)缺少一種 特異性好、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因 多態(tài)性檢測(cè)引物及其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1 和GSTM1基因多態(tài)性的引物與方法，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)的位點(diǎn)包 括父1?〇：1_1?3990:。.1196厶>6(?.6111399厶作）（5陬4825487)，￡1?〇：1_(：1181' :。.3541'>(：(口. Asnll8=) (SNP ：rsll615), ERCC2_L751Q ：c. 2251A>C(p. Lys751Gln) (SNP ：rsl3181), GSTP1_ I105V :c. 313A>G(p. Ilel05Val) (SNP :rsl695)，GSTMl_Loss :GSTM1 基因缺失。
[0007] 本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的引物，包括 PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴(kuò)增引物包括：針對(duì)XRCC1_R399Q的上游引物 5'-TCTGACTCCCCTCCAGAIT-3'（SEQ ID NO. 1)和下游引物5'-GCCCCTCAGATCACACCTA-3'（SEQ ID N0.2)，針對(duì) ERCC1_C118T 的上游引物 5'-TCCAGAACACTGGGACATGA-3'（SEQ ID NO.3)和下游引物 5' -TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3'（SEQ ID NO. 4)，針 對(duì) ERCC2_L751Q 的上游引物 5'-GGCAAGACTCAGGAGTCACC-3'（SEQ ID N0.5) 和下游引物 5'-CCCTCTCCCTTTCCTCTGTT-3'（SEQ ID N0.6)，針對(duì) GSTP1_ I105V 的上游引物 5' -ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3'（SEQ ID N0.7)和下游引物 5'-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3'（SEQ ID N0.8)以及針對(duì) GSTMl_Loss 的上游引物 5'-GA ACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3'（SEQ ID N0.9)和下游引物 5'-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3' (SEQ ID NO. 10);所述 SNaPshot PCR 引物包括：針對(duì) XRCC1_R399Q 的 SNaPshot PCR 引 物 5' -TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3'（SEQ ID NO. 12)，針對(duì) ERCC2_ L751Q 的 SNaPshot PCR 引物 5' -TTTTTTTAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG-3' （SEQ ID NO. 13)，針對(duì) GSTP1_I105V 的 SNaPshot PCR 引物 5' -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGAGGA CCTCCGCTGCAAATAC-3'（SEQ ID N0.14)以及針對(duì) GSTMl_Loss 的 SNaPshot PCR 引物5'-TTTTCATCATAGACGAGAAAATCTACAA -3' （SEQ ID N0.15)。
[0008] 采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài) 性的引物，可以實(shí)現(xiàn)XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的特異性檢測(cè)，不會(huì)發(fā) 生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好。
[0009]優(yōu)選地，所述 PCR 擴(kuò)增引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_ I105V 和 GSTMl_Loss 的引物濃度比為 1 :1 :1 :1 :1 ;所述 SNaPshot PCR 引物中，XRCC1_ R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和 GSTMl_Loss 的引物濃度比為 1 :1 :1 :1 : 1〇
[0010] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的方 法，包括如下步驟:A)提取DNA樣品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多 重PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；C)采用權(quán)利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物進(jìn) 行SNaPshot PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；D)毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn) 行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟A )中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1 :98°C 3min ;階段2 : 98°(：1〇8;階段3:581€3〇8;階段4 :72°(：11^11;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán)；階段6 : 72°C 5min;階段 7:25。(：保溫。即，St印 1:98。C for 3minutes;St印 2:98。C for 10 seconds ；Step 3 :58° C for 30 seconds ；Step 4 ：72° C for 1 minute ；Step 5 ：Go to step 2,29 times ；Step 6 :72° C for 5 minutes ；Step 7 ：25° C forever。
[0013] 所述步驟C)中的SNaPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1 :96°C 10s ;階段2 : 55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán)；階段5:4°C保溫。即，St印 1 ：96° C forlOseconds ；Step 2 ：55° C for 5 seconds ；Step 3 ：60° C for 30seconds ； Step 4 ：Go to step 1,25 times ；Step 5:4° C forever。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟D)中，采用GENEMAPPERID V4. 1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0015] 此外，本發(fā)明還提供同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的引物在制 備檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性試劑中的用途。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、 ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的引物，引物的特異性好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好， 實(shí)現(xiàn)了 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的同時(shí)檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。此外， 本發(fā)明還提供了一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的SNaPshot法，通 過(guò)使用特異性的PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等 優(yōu)點(diǎn)，可以為鉑類藥物的臨床用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1本發(fā)明提供的XRCC1/ERCC1基因引物的擴(kuò)增片段。
[0018] 圖2本發(fā)明提供的ERCC2/GSTP1/GSTM1基因引物的擴(kuò)增片段。
[0019] 圖3 XRCC1/ERCC1基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
[0020] 圖4 ERCC2/GSTP1/GSTM1基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
[0021] 圖5樣品的XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0023] 實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1的基因多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了大量引物， 通過(guò)引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好、不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)且PCR反應(yīng)條件 非常接近的引物。本發(fā)明提供的引物包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物，PCR擴(kuò)增引 物和SNaPshot PCR引物是相對(duì)應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)， 無(wú)已知SNP位點(diǎn)。
[0024]
實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting，XRCC1_R399Q引物擴(kuò)增片 段位于 chrl9: 44055651-44055888，長(zhǎng)度為 238bp ;ERCC1_C118T 引物擴(kuò)增片段 位于 chrl9: 45923504-45923722，長(zhǎng)度為 219bp ;ERCC2_L751Q 引物擴(kuò)增片段位 于 chrl9: 45854837+45855007，長(zhǎng)度為 171bp ;GSTP1_I105V 引物擴(kuò)增片段位于 chrll: 67352602-67352777,長(zhǎng)度為 176bp ;GSTMl_Loss 引物擴(kuò)增片段位于 chrl: 110232920-110233138,長(zhǎng)度為219bp ;結(jié)果如圖1至圖2所示，所有引物的擴(kuò)增片段均覆蓋 了相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)，無(wú)其它同源基因。
[0025] 使用表1中PCR擴(kuò)