退行性心臟瓣膜病相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程中退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，是一種退行性 必臟瓣膜病相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行病學(xué)與臨床研究表明，隨著人類壽命的延長(zhǎng)，生活環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變，退 行性必臟瓣膜病值egenerative valvular heart disease)的發(fā)病率不斷增加，現(xiàn)已成為 老年人必力衰竭、必律失常、暈厥及粹死的主要原因之一。退行性必臟瓣膜病的主要病理 變化是瓣膜結(jié)締組織退行性變、纖維化、增厚及巧化，從而引起瓣膜及其支架功能的改變。 病變類型主要有主動(dòng)脈瓣巧化、二尖瓣環(huán)巧化、二尖瓣巧化，W及兩個(gè)瓣膜同時(shí)存在的聯(lián)合 瓣膜巧化等。本病在所有的老年必臟瓣膜病中約占25%，在老年非風(fēng)濕性必臟瓣膜病中占 80%。國(guó)外報(bào)道該病老年人尸檢檢出率為60%至80%，超聲檢出率為74%;國(guó)內(nèi)資料顯示，該 病老年人尸檢檢出率為46. 1%，超聲檢出率為38. 8%至60. 2%。60歲W后瓣膜巧化檢出率呈 明顯的隨年齡增高趨勢(shì)，其中W主動(dòng)脈瓣巧化為主，其次為二尖瓣環(huán)巧化和二尖瓣巧化?？?見，退行性必臟瓣膜病已成為臨床必臟病學(xué)中廣泛存在的一個(gè)重要問題，應(yīng)引起大家的關(guān) 注。隨著研究的深入，人們對(duì)退行性必臟瓣膜病的認(rèn)識(shí)也有了很大的提高，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到退行 性必臟瓣膜病不只是一種單因素疾病，而是由多種內(nèi)源性及外源性因素共同決定的復(fù)雜性 疾病，除了高血壓，高血脂，糖尿病，吸煙等環(huán)境因素外，遺傳因素在退行性必臟瓣膜病發(fā)生 發(fā)展過(guò)程中也起到了重要作用。
[0003] 目前研究證明，慢性炎癥參與退行性必臟瓣膜病的發(fā)生、發(fā)展，其早期損害主要包 括：（1)慢性炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，主要是巨瞻細(xì)胞和T淋己細(xì)胞；（2)損傷區(qū)及她鄰纖維層脂 質(zhì)聚集；（3)纖維層增厚，包括膠原纖維及彈力纖維的聚集；(4)巧鹽沉積。其終末期損害主 要表現(xiàn)為主動(dòng)脈側(cè)瓣葉的非結(jié)合部位不規(guī)則纖維巧化斑積聚。鏡下可見瓣葉增厚、脂質(zhì)聚 集、膠原纖維排列奈亂，巧鹽沉積，炎性細(xì)胞趨向定位于損害的表面。肺炎衣原體是呼吸道 感染的常見原因，化voven等的研究發(fā)現(xiàn)，在狹窄及早期病變的主動(dòng)脈瓣膜上找到了肺炎衣 原體，在早期損害瓣膜的檢出率是83%，而在正常瓣膜的檢出率為44%。送些研究結(jié)果進(jìn)一步 說(shuō)明炎癥在退行性必臟瓣膜病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，宿主對(duì)感染的反應(yīng)可能 是疾病發(fā)生及發(fā)展的重要原因。
[0004] 白細(xì)胞介素（Interleukin)是由淋己細(xì)胞、單核細(xì)胞或其他非單核細(xì)胞產(chǎn)生 的細(xì)胞因子，在細(xì)胞間相互作用、免疫、炎癥和造血過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。白細(xì)胞介 素-10 (比-10)為一家族性細(xì)胞因子，主要包括比-19、比-20、比-24/ MDA-7、比-22/ IL-TIF及IL-26/ AK-155,它們是一類多功能的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要由化2細(xì)胞、活化的 B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨瞻細(xì)胞產(chǎn)生，可W通過(guò)抑制IL-1, TNF-a，IL-6,比-8，GM-CSF及MHC n等多種炎癥因子的產(chǎn)生來(lái)減弱TH1型反應(yīng)應(yīng)答的活性及單核細(xì)胞的功能，從而起到抑制 炎癥過(guò)程的作用；同時(shí)，比-10也是一種B細(xì)胞刺激因子，可W通過(guò)增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖和分 化，在細(xì)胞和體液免疫的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因此，部分學(xué)者認(rèn)為，比-10可通過(guò)參與慢 性炎癥過(guò)程，從而影響退行性必臟瓣膜病的發(fā)生和發(fā)展。
[0005] 基因?yàn)閱慰截惢?，位于lq31-32區(qū)域，共有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子?；驋?描分析發(fā)現(xiàn)該位置是退行性必臟瓣膜病的易感性區(qū)域。雙生子和家系研究都已表明，至少 75%的IL-10產(chǎn)物變異都是由IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)決定的，而且IL-10產(chǎn)物受轉(zhuǎn)錄水平的控 巧[J。比-10基因5'端區(qū)域包含許多多態(tài)性位點(diǎn)，直接影響比-10蛋白的表達(dá)?；痶k卵等 對(duì)德國(guó)187例重度主動(dòng)脈瓣巧化狹窄病人的主動(dòng)脈瓣膜組織進(jìn)行了 IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)基 因多態(tài)性的測(cè)定，并首次發(fā)現(xiàn)，比-10基因多態(tài)性與瓣膜巧化程度具有顯著相關(guān)性。近年來(lái) 關(guān)于IL-10基因多態(tài)性及編碼蛋白質(zhì)在必血管系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用逐漸引起了人 們關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑 盒、應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過(guò)W下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種退行性必臟瓣膜病相關(guān)基 因即比-10基因，該基因的核巧酸序列具有SEQ ID NO: 1所不的序列。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過(guò)W下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜 病相關(guān)基因的試劑，該試劑用于檢測(cè)IL-10基因rsl800871位點(diǎn)的多態(tài)性，該試劑包括如下 引物： 上游引物；5'AAACTTTAGACTCCAGCCACA 3' 下游引物；5'TGCCCATTCCAGAATACAA 3'。
[0009] 下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)： 上述試劑為用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合的試劑或用于 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與直接測(cè)序法相結(jié)合的試劑。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案之H是通過(guò)W下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種有體外檢測(cè)退行性必臟瓣 膜病相關(guān)基因的試劑的制劑或試劑盒，該試劑盒包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案之四是通過(guò)W下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜 病相關(guān)基因的試劑在制備用于體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的制劑或試劑盒中的 應(yīng)用。
[0012] 下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之四的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)： 上述試劑盒中包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。
[0013] 本發(fā)明對(duì)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒和應(yīng)用 做了詳細(xì)介紹，該體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑盒除了可W用于體外檢測(cè)退 行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的多態(tài)性外，還可W用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療退行性必臟瓣膜 病，從而降低退行性必臟瓣膜病的發(fā)生率，對(duì)預(yù)防和治療退行性必臟瓣膜病具有重大的意 義。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖巧本發(fā)明的rsl800871多態(tài)性位點(diǎn)的酶切圖譜。其中如泳道巧日3顯示待測(cè) 個(gè)體rsl800871位點(diǎn)的基因型為T/T純合子；泳道2, 4和6顯示待測(cè)個(gè)體的rsl800871位 點(diǎn)為C/T雜合子；泳道5和7顯示待測(cè)個(gè)體的rsl800871位點(diǎn)為C/C純合子。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，實(shí)施例 僅用于解釋而不W任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件進(jìn)行：如Sambrook等人所著的《分子克?。粚?shí)驗(yàn)手冊(cè)》（New fork: Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0016] 實(shí)施例1，一種退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因即比-10基因，該基因的核巧酸序列具 有SEQ ID NO: 1所示的序列。含有IL-10的基因的待測(cè)樣品可W從來(lái)自試驗(yàn)者的細(xì)胞獲 得，如來(lái)自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)、活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)自血液。
[0017] 實(shí)施例2, 一種體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑，該試劑用于檢測(cè) 比-10基因rsl800871位點(diǎn)的多態(tài)性，該試劑包括如下引物： 上游引物；5'AAACTTTAGACTCCAGCCACA 3' 下游引物；5'TGCCCATTCCAGAATACAA 3'。
[001引所謂"基因多態(tài)性"指的是在人群中，各個(gè)體基因的核巧酸序列存在的差異。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的多態(tài)性位點(diǎn)為單核巧酸多態(tài)性（SNP)位點(diǎn)，即基因組序 列中單核巧酸發(fā)生改變；核巧酸酸序列的差異可W體現(xiàn)在DNA水平上或者RNA水平上，所 W，本發(fā)明的退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因可W體現(xiàn)在DNA水平，RNA水平上，優(yōu)選DNA水平， 更優(yōu)選基因組DNA。
[0019]目前關(guān)于復(fù)雜性狀疾病的研究有兩種策略，連鎖分析的方法和病例-對(duì)照研究。 由于退行性必臟瓣膜病是一種多因素疾病，是由遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，因而采 用連鎖分析較為困難。從遺傳的角度分析，退行性必臟瓣膜病屬于復(fù)雜遺傳性狀疾病。對(duì) 該疾病的發(fā)生起作用的因素中，除環(huán)境因素外，起作用的基因總數(shù)估計(jì)多達(dá)上百條，各個(gè)基 因之間又存在著相互作用，基因又和環(huán)境之間存在相互作用。退行性必臟瓣膜病的發(fā)生具 有一定的家族聚集性，但更多的是一些散發(fā)病例。所W本發(fā)明采用病例對(duì)照研究。所述病 例對(duì)照研究就是在采用隨機(jī)挑選的兩組人群中（病例和對(duì)照）比較某等位基因的頻率。
[0020] 本發(fā)明在新疆漢族人群中通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析（194例退行性必臟瓣膜病患者和411例 對(duì)照），經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，最后W確鑿的證據(jù)證明了具有本發(fā)明的rsl800871多態(tài)性位點(diǎn)的 比-10基因?yàn)橥诵行员嘏K瓣膜病相關(guān)基因，T等位基因的攜帶者患退行性必臟瓣膜病的危 險(xiǎn)性較C等位基因攜帶者增加了 1.9倍。
[0021] 實(shí)施例3,作為上述實(shí)施例2的優(yōu)選，該試劑為用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段 長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合的試劑或用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與直接測(cè)序法相結(jié)合的試劑。試劑盒 中檢測(cè)rsl800871位點(diǎn)的試劑根據(jù)檢測(cè)方法的不同而不同，例如，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合方法來(lái)檢測(cè)rsl800871多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，試劑盒中可W含 有限制性內(nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜，例如Mae III限制性內(nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜。
[0022] 實(shí)施例4, 一種有體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑的制劑或試劑盒， 該試劑盒包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。本發(fā)明檢測(cè)rsl800871位點(diǎn)多態(tài)性的退行性 必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑盒可W用于體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的多態(tài)性； rsl800871位點(diǎn)突變的退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑盒可W用于檢巧1|、預(yù)防、診斷或治 療退行性必臟瓣膜??；體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的方法可W用于檢測(cè)、預(yù)防、診 斷或治療退行性必臟瓣膜病。
[0023] 實(shí)施例5, 一種體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑在制備用于體外檢測(cè) 退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的制劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明檢測(cè)rsl800871位點(diǎn)多態(tài)性 的退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的試劑盒可W用于體外檢測(cè)退行性必臟瓣膜病相關(guān)基因的 多態(tài)性；rsl800871位點(diǎn)突變的退行