4小時(shí)后取出與細(xì)胞培養(yǎng)過的化學(xué)成分 確定的培養(yǎng)基，稱為條件培養(yǎng)基（conditioned medium)，以13, OOOrpm離心五分鐘后取上 清液。于300 μ 1條件培養(yǎng)基中加入IOng Aβ 40與試驗(yàn)藥物，使其于37°C反應(yīng)24小時(shí)后， 用免疫分析試劑（Human Af^HciImmunoassay kits，Cat. KHB3482，Life Technologies)來 測量各反應(yīng)中所殘留的Αβ量，來檢視試驗(yàn)藥物是否可促進(jìn)培養(yǎng)基中酵素降解Αβ的活性。 以未加入任何試驗(yàn)藥物（僅含IOng Αβ)設(shè)定為對(duì)照組，其所測得的Αβ含量設(shè)為100%， 經(jīng)藥物處理后所得到的Αβ含量則與對(duì)照組做比對(duì)，并以百分比表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖5， 其是顯示四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（η = 4)，而對(duì)照組與測試樣品組間以杜納多重 比較檢定（Dunnett' s multiple comparison test)分析其統(tǒng)計(jì)差異，其中以表示ρ < 0· 05 ;以 "**" 表示 p < 0· 01 ;以 "***" 表示 p < 0· 001 ;并以 "****" 表示 ρ〈0· 0001。
[0189] 根據(jù)圖5的試驗(yàn)結(jié)果顯示，以未加入任何藥物（C)所得的Αβ40含量值設(shè)為 100%，其余數(shù)值則作相對(duì)應(yīng)的調(diào)整，結(jié)果以百分比表示的。樣品9在50 μ M及100 μ M的濃 度下均可有效促進(jìn)細(xì)胞外A β 40的分解。
[0190] 因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例五的結(jié)果可知，本發(fā)明的異類葉升麻苷衍生物確實(shí)具有Αβ降 解的功效。
[0191] 實(shí)驗(yàn)例六、預(yù)防眼睛病變的試驗(yàn)
[0192] 人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（Human retinal pigment epithelium cell，ARPE-19) 培養(yǎng)在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液（Life Techonlogies)中，達(dá)90%滿時(shí)分盤于96孔盤中，每個(gè)孔洞種4. 5X103個(gè)細(xì)胞。隔天將樣 品2及8以二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO)稀釋至試驗(yàn)濃度的200倍，再加入適 量含5%胎牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液，稀釋至試驗(yàn)濃度的2倍，再與0.21111叔丁基過氧化 氫（tert-butyl hydroperoxide，tBHP，Sigma)等比例混合至試驗(yàn)濃度（含0.5%二甲基亞 砜）加入含細(xì)胞的孔盤中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱反應(yīng)24小時(shí)后，利用MTT溶液進(jìn)行測量細(xì)胞存 活率。以波長570nm測定吸光值，將未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞設(shè)為控制組，其所取得的吸光值取 平均值并設(shè)定為100%，經(jīng)藥物處理的細(xì)胞所取得的吸光值則依據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞存活 率：
[0193] 細(xì)胞存活率：（實(shí)驗(yàn)組吸光值/控制組平均吸光值）*100%。
[0194] 叔丁基過氧化氫是一種有機(jī)過氧化氫，會(huì)經(jīng)由自由基代謝，接者引起脂質(zhì)氧化與 細(xì)胞分子產(chǎn)生共價(jià)鍵結(jié)而對(duì)細(xì)胞造成損傷，因此常被廣泛應(yīng)用于氧化壓力造成細(xì)胞損傷的 研宄中。
[0195] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖6A~圖6B，其是顯示六個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（η = 6)， 而傷害組（接受傷害藥物，無保護(hù)藥物）和測試藥物組及控制組（Control ;含0· 5% DMS0) 間以杜納多重比較檢定分析其統(tǒng)計(jì)差異，結(jié)果表示："*"表示P<〇.〇5 表示p<0.01 ; " *** " 表示 P < 〇· 〇〇 1 ; " **** " 表示 ρ〈〇· 〇〇〇 1。
[0196] 根據(jù)圖6Α~6Β的試驗(yàn)結(jié)果顯示，人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在tBHP存在下會(huì)造成 30%~40%細(xì)胞死亡，但分別加入樣品2 (濃度分別為6. 25 μ M、12. 5 μ M、以及25 μ M)及樣 品8 (濃度分別為8. 75 μ Μ、17. 5 μ Μ、以及35 μ Μ)可明顯抑制人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞死 亡，甚至存活率優(yōu)于控制組。
[0197] 因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例六的結(jié)果可知，本發(fā)明的異類葉升麻苷衍生物對(duì)于叔丁基過氧 化氫所造成的人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化壓力損傷確具有保護(hù)作用。
[0198] 綜上所述，本發(fā)明提供一種異類葉升麻苷衍生物，包含異類葉升麻苷衍生物的藥 物具有抑制類淀粉勝肽聚集、預(yù)防眼部病變等功效。
[0199] 雖然本發(fā)明已以實(shí)施方式揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟習(xí)此技藝 者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng) 視后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種異類葉升麻苷衍生物，具有式（I)的結(jié)構(gòu)：在該式（I)中，R^SR2是獨(dú)立選自氫、鹵素、羥基、或烴氧基，1?3及R4是獨(dú)立選自羥基、 烴氧基或酰氧基，R5是獨(dú)立選自羥基或酰氧基。2. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R /或R 2為烴氧基時(shí)，其是獨(dú) 立選自烷氧基、條氧基或芳氧基。3. 如權(quán)利要求2所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R及/或R 2為烷氧基時(shí)，其是甲 氧基。4. 如權(quán)利要求2所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R /或R 2為烯氧基時(shí)，其是烯 丙氧基。5. 如權(quán)利要求2所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R及/或R 2為芳氧基時(shí)，其是芐 氧基。6. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R 3及/或R 4為烴氧基時(shí)，其是獨(dú) 立選自烯氧基或芳氧基。7. 如權(quán)利要求6所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R 3及/或R 4為烯氧基時(shí)，其是烯 丙氧基。8. 如權(quán)利要求6所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R 3及/或R 4為芳氧基時(shí)，其是芐 氧基。9. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R 3及/或R 4為酰氧基時(shí)，其是乙 酰氧基。10. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中R3及R4是相同的取代基。11. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中當(dāng)R5為酰氧基時(shí)，其是乙酰氧基。12. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中R5是相同的取代基。13. 如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物，其中該異類葉升麻苷衍生物是選自以 下的結(jié)構(gòu)：14. 一種如權(quán)利要求1所述的異類葉升麻苷衍生物的用途，其是用于制備治療或預(yù)防 與類淀粉勝肽相關(guān)疾病的藥物。15. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中該與類淀粉勝肽相關(guān)疾病為神經(jīng)退化性疾病。16. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中該與類淀粉勝肽相關(guān)疾病為阿茲海默氏病、輕度 認(rèn)知障礙、路易體性癡呆、唐氏癥候群、遺傳性腦出血并發(fā)淀粉樣變性?。ê商m型）；關(guān)島帕 金森癡呆復(fù)合癥、進(jìn)行性核上麻痹、多發(fā)性硬化、庫賈氏病、帕金森氏病、額顳葉型失智癥、 皮克病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、包涵體肌炎、成人發(fā)病的糖尿病、老年性心肌淀粉樣變性病或 內(nèi)分泌腫瘤。17. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中該與類淀粉勝肽相關(guān)疾病為眼部病變。18. 如權(quán)利要求14項(xiàng)所述的用途，其中該與類淀粉勝肽相關(guān)疾病為神經(jīng)元退化、視覺 皮質(zhì)缺損、青光眼、白內(nèi)障、眼部淀粉樣變性病、黃斑部病變性、視神經(jīng)玻璃疣、視神經(jīng)病變、 視神經(jīng)炎或網(wǎng)格狀營養(yǎng)不良。19. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中該類淀粉勝肽是β -類淀粉勝肽。20. -種異類葉升麻苷衍生物的制造方法，包含： 將具有式（II)的結(jié)構(gòu)的化合物與β-D-葡萄糖五乙酸酯反應(yīng)，以形成具有式（III)的 結(jié)構(gòu)的化合物， 其中該式（Π )為：該式（III)為：在該式（II)以及該式（III)中，R2是獨(dú)立選自氫、氯、甲氧基或芐氧基； (1)將該具有式（III)的結(jié)構(gòu)的該化合物與鈀碳以及甲醇的混合物反應(yīng)，移除該鈀碳 并純化后，與碳酸鉀、烯丙基溴以及丙酮混合，經(jīng)回流后，于氫氧化鉀-甲醇溶液中反應(yīng)，以 形成具有式（IV-I)的結(jié)構(gòu)的化合物，其中該式（IV-I)為：在該式（IV-I)中，馬及1?4是獨(dú)立選自氫或烯丙氧基，（2)將該具有式（III)的結(jié)構(gòu)的該 化合物溶于甲醇中，并與甲醇鈉混合，以形成具有該式（IV-I)的結(jié)構(gòu)的化合物，其中馬及 R4是獨(dú)立選自氫、氯、甲氧基或芐氧基，或（3)將該具有式（III)的結(jié)構(gòu)的該化合物與乙酰 氯以及甲醇-二氯甲烷反應(yīng)，以形成具有式（IV-2)的結(jié)構(gòu)的化合物，其中該式（IV-2)為：在該式（IV-2)中，1?5及1?6是獨(dú)立選自氫或氯；以及 將該具有式（IV-I)的結(jié)構(gòu)的該化合物或該具有式（IV-2)的結(jié)構(gòu)的該化合物與 二-鄰-乙?；⑽核崧然?、二-鄰-烯丙基阿魏酸氯化物或二-鄰-芐基阿魏酸氯化 物于含有二氯甲烷及吡啶的溶液中反應(yīng)，以形成具有式（V-I)~（V-4)任一結(jié)構(gòu)的化合物， 其中該式（V-I)為：在該式（V-I)中，&及R8是獨(dú)立選自氫或烯丙氧基，該式（V-2)為：在該式（V-2)中，馬及Rltl是獨(dú)立選自氫、甲氧基或節(jié)氧基，該式（V-3)為：在該式（V-3)中，R11及R12是獨(dú)立選自氫、甲氧基或節(jié)氧基，該式（V-4)為：在該式（V-4)中，R13及R14是獨(dú)立選自氫或氯。21. 如權(quán)利要求20所述的制造方法，更包含將該具有式（V-I)的結(jié)構(gòu)的該化合物與氯 化亞銅及氯化鈀于甲醇及水的混合物中反應(yīng)，以形成具有式（VI-I)的結(jié)構(gòu)的化合物，其中 該式（VI-I)為：在該式（VI-I)中，R15及R16是獨(dú)立選自氫或羥基。22. 如權(quán)利要求20所述的制造方法，更包含將該具有式（V-2)的結(jié)構(gòu)的該化合物與含 甲胺的甲醇反應(yīng)，以形成具有式（VI-I)的結(jié)構(gòu)的化合物，其中該式（VI-I)為：在該式（VI-I)中，R15及R16是獨(dú)立選自氫、氯、甲氧基或芐氧基。23. 如權(quán)利要求20所述的制造方法，更包含將該具有式（V-4)的結(jié)構(gòu)的該化合物與含 甲胺的甲醇反應(yīng)，以形成具有式（VI-2)的結(jié)構(gòu)的化合物，其中該式（VI-2)為：在該式（VI-2)中，R17及R18是獨(dú)立選自氫或氯。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種異類葉升麻苷衍生物及其制造方法與用途。異類葉升麻苷衍生物具有式(I)的結(jié)構(gòu)：在式(I)中，R1及R2是獨(dú)立選自氫、鹵素、羥基、或烴氧基，R3及R4是獨(dú)立選自羥基、烴氧基或酰氧基，R5是獨(dú)立選自羥基或酰氧基。包含本發(fā)明的異類葉升麻苷衍生物的藥物具有治療或預(yù)防類淀粉勝肽相關(guān)疾病及預(yù)防眼部病變等用途。
【IPC分類】C07H1/00, A61K31/7032, A61P27/06, A61K31/7028, A61P27/02, A61P27/12, A61P25/28, A61P21/00, C07H15/18, A61P25/00, A61P3/10, A61P25/16
【公開號(hào)】CN104974199
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510170275
【發(fā)明人】蘇慕寰, 林漢欽, 胡明寬, 李易達(dá), 王昭日
【申請(qǐng)人】杏輝天力（杭州）藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年4月10日
【公告號(hào)】US20150291645, WO2015154721A1