從中藥猴耳環(huán)中提取的化合物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及猴耳環(huán)中三個(gè)新化合物及其制備方法，本發(fā)明還 涉及所述的新化合物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性。我們生物體系主要 遇到的是氧自由基，例如超氧陰離子自由基、羥自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮 自由基。加上過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧和臭氧，通稱活性氧。過(guò)多的活性氧自由基可損害機(jī)體的 組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病如心臟病、老年癡呆癥、帕金森病、腫瘤及衰老效應(yīng)。活性氧 自由基對(duì)人體的損害實(shí)際上是一種氧化過(guò)程，因此，要降低自由基的損害，就得從抗氧化來(lái) 實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所涉及的三個(gè)化合物是通過(guò)對(duì)猴耳環(huán)提取物制備獲得，為未見(jiàn)報(bào)道的三個(gè)新 化合物，具有很好的自由基清除活性，從而達(dá)到抗氧化的效果，是三個(gè)具有很大潛在價(jià)值的 藥物先導(dǎo)化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的目的之一是從猴耳環(huán)嫩枝和葉中尋找新的抗氧化前體藥物，本發(fā)明的目 的之二是提供該新化合物的提取、制備方法，并且研宄它們的抗氧化生物活性和醫(yī)藥用途， 本發(fā)明的目的之三在于提供該新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定方法，本發(fā)明的目的之四在于提供三個(gè) 新化合物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明所述的三個(gè)具有抗氧化活性的新化合物5-烯丙基-5'-(2-羥丙基） [1，1' -聯(lián)苯]-2, 2' -二醇，5_條丙基_5' - (2, 3_二羥基-1-甲氧基丙基）[1，1_聯(lián) 苯]-2, 2'-二醇，1-(3'-甲氧基，4'-羥基苯基）-3-(2"，6"-二甲氧基-4"-羥基苯基） 丙烷-2-醇，其結(jié)構(gòu)如下所示：
[0006] 本發(fā)明所述三個(gè)新化合物的提取、制備方法如下：
[0007] (1)取干燥的猴耳環(huán)嫩枝和葉，用60~75 %乙醇回流提取，合并提取液并減壓濃 縮后得總浸膏，總浸膏用水混懸后，經(jīng)D101大孔樹(shù)脂分別以水和體積分?jǐn)?shù)25%~35%、 55 %~65 %、85 %~95 %的乙醇水洗脫，85 %~95 %乙醇洗脫物采用快速減壓柱色譜，以 二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)50:1~2:1逐漸洗脫，得到15~20個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層 層析檢識(shí)，將流分合并為A1~A5。
[0008] (2)流分A1 (50:1~30:1的洗脫流分）再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng)40 %~ 90 %逐漸洗脫，得到12~18個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為F1~F3。流分 F2再經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)30:1~1:1逐漸洗脫，得到20~30 個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為B1~B7。利用HPLC法以甲醇-水（50%~ 65% )為流動(dòng)相在B2~B6中制備得到化合物1和3。
[0009] (3)流分A2 (30:1~15:1的洗脫流分）再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng)40%~ 80 %逐漸洗脫，得到15~20個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為C1~C5。流分 C2再經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)15:1~1:1逐漸洗脫，得到20~ 30個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為D1~D5。利用HPLC法以甲醇-水（50%~ 65% )為流動(dòng)相在D2~D4中制備得到化合物2。
[0010] 所述提取為回流提取，提取3~5次，每次2~3小時(shí)。
[0011] 所述的制備方法，其特征在于，所述的用于HPLC的甲醇-水的比例為50 %~ 65%〇
[0012] 所述猴耳環(huán)是指豆科猴耳環(huán)屬植物猴耳環(huán)（Pithecellobiumclypearia Benth.)〇
[0013] 具體地：所述三個(gè)化合物的制備方法如下：
[0014] 取干燥的猴耳環(huán)嫩枝和葉15~19kg，用5~7倍量的60~75%工業(yè)乙醇回流提 取3~5次，每次2~3小時(shí)，合并提取液并減壓濃縮后得總浸膏1. 5~2. 0kg，總浸膏用 8~10L水混懸后，經(jīng)D101大孔樹(shù)脂分別以水和體積分?jǐn)?shù)30%、60%、95%的乙醇水洗脫， 得到的30%層干浸膏90~11(^，60%層干浸膏300~40(^，95%層干浸膏180~21(^， 水層干浸膏290~320g。95%乙醇洗脫物采用快速減壓柱色譜，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng) 50:1~2:1逐漸洗脫，得到15~20個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為A1~A5。
[0015] 流分A1 (40~60g)再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng)40 %~90 %逐漸洗脫，得到 12~18個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為F1~F3。流分F2再經(jīng)硅膠柱色譜， 以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)30:1~1:1逐漸洗脫，得到20~30個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)， 將流分合并為B1~B7。利用HPLC法以甲醇-水為流動(dòng)相在B2~B6中制備得到化合物1 和3〇
[0016] 流分A2 (40~60g)再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng)40 %~80 %逐漸洗脫，得到 15~20個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為C1~C5。流分C2再經(jīng)硅膠柱色譜， 以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)15:1~1:1逐漸洗脫，得到20~30個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)， 將流分合并為D1~D5。利用HPLC法以甲醇-水為流動(dòng)相在D2~D4中制備得到化合物 2〇
[0017] 本發(fā)明所述三個(gè)新化合物具有較好的抗氧化活性。ABTS自由基清除活性試驗(yàn)方法 如下：
[0018] 1?實(shí)驗(yàn)材料
[0019] 1.1受試品：化合物
[0020] 1. 2試劑：ABTS(華藍(lán)化學(xué)試劑公司），Trolox(華藍(lán)化學(xué)試劑公司）， PBS(Silarbio公司）
[0021] 2?實(shí)驗(yàn)方法
[0022] 2. 1藥物處理
[0023] 藥物的溶解
[0024] 化合物和Trolox用無(wú)水乙醇配制成100、50、10、5、1yg?ml5個(gè)濃度；PBS用蒸 餾水配制成0. 01M;ABTS用配好的PBS配制成3. 84mg^!/1，然后與0. 66mg的過(guò)硫酸 鉀溶液按體積比1:1混合均勻，室溫避光放置12_16h，即生成ABTS+，再用PBS將其稀釋10 倍待用。
[0025] 2. 1實(shí)驗(yàn)操作
[0026] 加不同濃度樣品溶液（l、5、10、50、100yg?mLllOOyL與配制好的ABTS+溶液 150yL于96孔酶標(biāo)板中，震蕩lmin，放置30min，用酶標(biāo)儀在734nm下測(cè)定其吸光度值 (S)，同時(shí)測(cè)定樣品PBS對(duì)照組吸光度值（SB)，ABTS陰性對(duì)照組吸光度值（C)和無(wú)水乙醇PBS空白對(duì)照組吸光度值（CB)。以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照物，如下計(jì)算自由基清除率：抑制率 (八8丁5+清除率）=[1-(5-58)八008)]\100%
[0027] 2. 2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
[0028] 全部資料采用SPSS(16. 0)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行檢驗(yàn)分析，結(jié)果采用IC5(I值來(lái)評(píng)估樣品 抗氧化活性。
[0029] 2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0030] 測(cè)定了化合物1-3的ABTS自由基清除活性，結(jié)果表明三個(gè)化合物均有很好的清除 自由基活性，化合物1-3的IC5Q值分別為14. 941，7. 652, 9. 772yg?mL―1，陽(yáng)性對(duì)照Trolox 的IC5Q值為14. 152yg?mL'可看出，除化合物1的活性與陽(yáng)性藥相當(dāng)之外，化合物2和 3的活性都比陽(yáng)性藥好。
[0031] 本發(fā)明所涉及從猴耳環(huán)中分離得到的三個(gè)新化合物，均具有很好的抗氧化活性， 是三個(gè)具有很大潛在價(jià)值的藥物先導(dǎo)化合物。
[0032] 本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，提取純度高。獲得的化合物具有很好的抗氧化活 性作用。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖 1 為 1 的1H-NMR
[0034]圖 2 為 1 的 13C_NMR
[0035]圖 3 為 1 的HSQC
[0036]圖 4 為 1 的HMBC
[0037]圖 5 為 2 的1H-NMR
[0038]圖 6 為 2 的 13C_NMR
[0039] 圖 7 為 2 的HSBC
[0040]圖 8 為 2 的HMBC
[0041]圖 9 為 3 的1H-NMR
[0042]圖 10 為 3 的 13C_NMR
[0043]圖 11 為 3 的HSBC
[0044]圖 12 為 3 的HMBC。
【具體實(shí)施方式】：
[0045] 制備實(shí)施例1
[0046] 取干燥的猴耳環(huán)嫩枝和葉19kg，用6倍量的70%工業(yè)乙醇回流提取3次，每次3 小時(shí)，合并提取液并減壓濃縮后得總浸膏1. 9kg，總浸膏用10L水混懸后，經(jīng)D101大孔樹(shù)脂 分別以水和體積分?jǐn)?shù)30 %、60 %、95 %的乙醇水洗脫，得到的水層干浸膏310g，30 %層干浸 膏107g，60%層干浸膏380g，95%層干浸膏200g。95%乙醇洗脫物采用快速減壓柱色譜，以 二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)50:1、30:1、15:1、8:1、5:1、2:1逐漸洗脫，得到18個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層 層析檢識(shí)，將流分合并為A1~A5。
[0047]流分Al(50g)再經(jīng) 0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng) 40%、50%、60%、70%、80%、90% 逐漸洗脫，得到18個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為F1~F3。流分F2再經(jīng)硅 膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)30:1、15:1、8:1、5 :1、3:1、1:1逐漸洗脫，得到24個(gè)流分， 經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為B1~B7。利用HPLC法以甲醇-水系統(tǒng)65%為流動(dòng)相 在B5中制備得到化合物1，甲醇-水系統(tǒng)60%為流動(dòng)相在B4中制備得到化合物3。
[0048] 流分A2(56g)再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng)40%、50%、60%、70%、80%逐漸 洗脫，得到20個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為C1~C5。流分C2再經(jīng)硅膠柱色 譜，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)15:1、8:1、5:1、3 :1、2:1、1:1逐漸洗脫，得到24個(gè)流分，經(jīng)硅膠 薄層層析檢識(shí)，將流分合并為D1~D5。利用HPLC法以甲醇-水系統(tǒng)60%為流動(dòng)相在D2 中制備得到化合物2。
[0049] 制備實(shí)施例2
[0050] 取干燥的猴耳環(huán)嫩枝和葉17kg，用5倍量的75%工業(yè)乙醇回流提取4次，每次2 小時(shí)，合并提取液并減壓濃縮后得總浸膏1. 7kg，總浸膏用9L水混懸后，經(jīng)D101大孔樹(shù)脂分 別以水和體積分?jǐn)?shù)30 %、60 %、95 %的乙醇水洗脫，得到的水層干浸膏300g，30 %層干浸膏 100g，60%層干浸膏360g，95%層干浸膏190g。95%乙醇洗脫物采用快速減壓柱色譜，以二 氯甲烷-甲醇系統(tǒng)50:1、30:1、15:1、8:1、5:1、3:1逐漸洗脫，得到18個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層 析檢識(shí)，將流分合并為A1~A5。
[0051]流分Al(40g)再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng) 40%、50%、60%、70%、80%、90% 逐漸洗脫，得到16個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為F1~F3。流分F2再經(jīng)硅膠 柱色譜，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)35:1、15:1、8:1、5:1、3:1、1:1逐漸洗脫，得到28個(gè)流分，經(jīng) 硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為B1~B7。利用HPLC法以甲醇-水系統(tǒng)65%為流動(dòng)相在 B4中制備得到化合物1，甲醇-水系統(tǒng)63%為流動(dòng)相在B3中制備得到化合物3。
[0052] 流分A2(45g)再經(jīng)0DS柱色譜，以甲醇-水系統(tǒng)40%、50%、60%、70%、80%逐漸 洗脫，得到15個(gè)流分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，將流分合并為C1~C5。流分C2再經(jīng)硅膠柱色 譜，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)15:1、8:1、5:1、3 :1、2:1、1:1逐漸洗脫，得到25個(gè)流分，經(jīng)硅膠 薄層層析檢識(shí)，將流分合并為D1~D5。利用HPLC法以甲醇-水系統(tǒng)65%為流動(dòng)相在D3 中制備得到化合物2。
[0053] 制備實(shí)施例3
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