488熒光染料綴合的抗組氨酸抗體檢測。VHH 3E6與葉表面和馬鈴薯葉盤邊緣 受傷的植物組織結(jié)合，其在通過葉穿孔制備樣品時造成。
[0084] 圖2 :結(jié)合結(jié)構(gòu)域（VHH)與完整活植物的結(jié)合
[0085] 圖2A :PBS中5 μ g/ml的VHH 3E6與完整活植物結(jié)合。將與盆栽馬鈴薯植物連接 的葉浸沒于VHH 3E6溶液中。取葉樣品。用直接與Alexa-488熒光染料綴合的抗組氨酸抗 體檢測。VHH 3E6結(jié)合葉表面、氣孔、腺表皮毛和葉毛。
[0086] 圖2B :PBS中5 μ g/ml的VHH 3E6與完整活植物結(jié)合。將與盆栽馬鈴薯植物連接 的葉浸沒于VHH 3E6溶液中。取葉樣品。用直接與Alexa-488熒光染料綴合的抗組氨酸抗 體檢測。截取自全葉標記。VHH 3E6結(jié)合葉表面、氣孔、腺表皮毛和葉毛。
[0087] 圖3 :結(jié)合結(jié)構(gòu)域與微膠囊的偶聯(lián)
[0088] 圖3A :通過1步EDC偶聯(lián)化學偶聯(lián)有VHH 3E6的微膠囊。用直接與Alexa-488熒 光染料綴合的抗組氨酸抗體標記偶聯(lián)的微膠囊。用Leica SP5共聚焦顯微鏡系統(tǒng)成像。通 過1步偶聯(lián)化學將VHH 3E6與微膠囊表面偶聯(lián)。
[0089] 圖3B :通過2步EDC/NHS偶聯(lián)化學偶聯(lián)有VHH 3E6的微膠囊。用直接與Alexa-488 熒光染料綴合的抗組氨酸抗體標記偶聯(lián)的微膠囊。用Leica SP5共聚焦顯微鏡系統(tǒng)成像。 通過2步EDC/NHS偶聯(lián)化學將VHH 3E6與微膠囊表面相偶聯(lián)。
[0090] 圖3C :不通過共價偶聯(lián)將微膠囊與VHH 3E6孵育。用直接與Alexa-488熒光染料 綴合的抗組氨酸抗體標記被動吸附的VHH。用Leica SP5共聚焦顯微鏡系統(tǒng)成像。較小部 分的VHH 3E6被動吸附至微膠囊表面。
[0091] 圖3D :不與VHH孵育而僅與直接綴合于Alexa-488熒光染料的抗組氨酸抗體孵育 的微膠囊作為對照條件。用Leica SP5共聚焦顯微鏡系統(tǒng)成像。較小部分的VHH 3E6被動 吸附至微膠囊表面。
[0092] 圖4 :微膠囊與葉表面的結(jié)合和保留
[0093] 含熒光示蹤分子的微膠囊在天然馬鈴薯葉盤上的葉盤結(jié)合測定。對比了偶聯(lián)有特 異性植物結(jié)合VHH的微膠囊、偶聯(lián)有無關(guān)對照VHH的微膠囊或空白微膠囊的結(jié)合和保留。與 空白微膠囊相比，9倍的偶聯(lián)有特異性VHH的微膠囊結(jié)合并保留在馬鈴薯葉盤上。
[0094] 圖5 :使用偶聯(lián)有靶向劑的微膠囊劑量的減少
[0095] 含熒光示蹤分子的微膠囊在天然馬鈴薯葉盤上的葉盤結(jié)合測定。對比了不同濃度 的微膠囊和偶聯(lián)有特異性植物結(jié)合VHH的微膠囊、偶聯(lián)有無關(guān)對照VHH的微膠囊或空白微 膠囊的結(jié)合和保留。與空白微膠囊相比，多至8倍的偶聯(lián)有特異性VHH的微膠囊結(jié)合并保 留在馬鈴薯葉盤上。 實施例
[0096] 實施例1 :VHH的產(chǎn)生和選擇
[0097] 用阿拉伯樹膠、馬鈴薯葉勻漿或小麥葉勻漿免疫美洲駝（llama)
[0098] 稱量5g來自金合歡樹的阿拉伯樹膠（Sigma)并溶解于50ml水制備阿拉伯樹膠溶 液。使用Bradford蛋白質(zhì)測定確定總蛋白質(zhì)濃度。進行分裝，儲存于-80°C并用于免疫。 在液氮中冷凍葉并用研缽和研杵將所述葉勻質(zhì)化直至獲得細粉制備馬鈴薯植物（Solanum tuberosum D6sir6e品種）或小麥植物（Triticum aestivum Boldus品種）的勾質(zhì)化的葉。 使用Bradford蛋白質(zhì)測定確定總蛋白質(zhì)濃度。進行分裝，儲存于-80°C，懸浮液用于免疫。
[0099] 根據(jù)標準步驟，以每周間隔，肌肉注射阿拉伯樹膠、勻質(zhì)化的馬鈴薯葉或勻質(zhì)化的 小麥葉6次免疫美洲駝。用阿拉伯樹膠免疫2只美洲駝，"404334"和"LahaYana"。用勻 質(zhì)化的馬鈴薯葉免疫3只美洲駝，"407928"、"Chilean Autumn"和"Niagara"，而用小麥葉 免疫另外2只美洲駝"33733"和"Organza"。使用佐劑LQ(Gerbu)免疫美洲駝"404334"、 "407928"和"33733"，而使用弗氏不完全佐劑（FIA)免疫美洲駝"LahaYana"、"Chilean Autumn"、"Niagara" 和"Organza"。用于免疫美洲駝"404334" 的劑量為第 0、7、14、21、28、 35天每天350 μ g，在第40天收集外周血淋巴細胞（PBL)。用于免疫美洲駝"407928"和 "33733"的劑量為第0、7、14、21、28、36天每天lmg，在第40天收集PBL。在第40天收集PBL 的時候，收集美洲駝"404334"、"407928"和"33733"的血清。用于免疫美洲駝"1^11也仙" 、"Chilean Autumn"、"Niagara"和"Organza" 的劑量為第 0 天 100 μ g 而第 7、14、21、28 和 35天50 μ g。在第0天、第25天和收集PBL的時候，收集美洲駝"Laha'iana"、"Chilean Autumn"、"Niagara" 和 "Organza" 的血清。
[0100] 文庫構(gòu)建-對每只被免疫的美洲駝制作了獨立的VHH文庫。從外周血淋巴細胞分 離RNA，隨后根據(jù)制造商說明使用隨機六聚體引物和Superscript III(Invitrogen)合成 cDNA。使用正向引物混合物[1:1 比例的 cal100 1(5' -gtcctggctgctcttctacaagg-3'）和 callOOlb (5' -cctggctgctcttctacaaggtg-3'）]和反向引物 cal100 2 (5' -ggtacgtgctgttga actgttcc-3 '）進行第一輪PCR以擴增VHH和VH。分離VHH片段后，使用正向引物A6E (5 '-g atgtgcagctgcaggagtctggrggagg-3'）和反向弓丨物 38 (S'-ggactagtgcggccgctggagacggtgac ctgggt-3'）進行第二輪PCR。使用限制性酶PstI和Eco91I (Fermentas)消化PCR片段，并 將其連接于PMES4載體（GenBank:GQ907248. 1)中pill基因的上游。根據(jù)標準方案將連接 產(chǎn)物乙醇沉淀，重懸于水中并電穿孔轉(zhuǎn)化入TGl細胞。文庫大小為從1E+08至6E+08個獨立 的克隆。對從文庫中隨機挑選的克隆進行單菌落PCR以評估文庫的插入百分比。所有的文 庫具有多90%的插入百分比，除了來自免疫的美洲駝"Organza"的文庫具有80%的插入百 分比。美洲駝"404334"、"407928"、"33733"、"ChileanAutumn"、"Laha'iana，，、"Niagara" 和"Organza"的文庫分別編號為25、27、28、29、30、31、32。根據(jù)標準步驟使用VCSM13輔助 噬菌體生產(chǎn)每個文庫的噬菌體。
[0101] 針對阿拉伯樹膠、植物表皮提取物或全葉的噬菌體選擇。
[0102] 稱量5g阿拉伯樹膠并溶解于50ml水制備阿拉伯樹膠溶液。進行分裝并儲存 于-20°C直至使用。由馬鈴薯植物莖的薄片（thin strips)制備馬鈴薯植物角質(zhì)層和粘附 表皮（adhering epidermis)提取物。由小麥鞘葉的薄片制備小麥植物角質(zhì)層和粘附表皮 提取物。依次分別使用CDTA和NaOH(Molle等人，2007)提取富集細胞壁聚糖和非纖維素多 糖的提取物。薄片冷凍于液氮并用研缽和研杵研磨直至獲得細粉。通過使用每克研磨材料 IOml 50mM pH 6. 5的⑶TA重懸細粉并在4°C顛倒旋轉(zhuǎn)30分鐘制備細胞壁聚糖富集的提取 物。使用裝配有濾器的注射器分離提取物和不溶性材料。通過在微型離心機中20, OOOg離 心5分鐘進一步清洗提取物。使用每克不溶性材料IOml 4M NaOH和1% NaBH4，并在4°C顛 倒旋轉(zhuǎn)30分鐘從CDTA提取后的不溶性材料中制備非纖維素多糖富集的提取物。使用裝配 有濾器的注射器分離提取物和不溶性材料。通過在微型離心機中20, OOOg離心5分鐘進一 步清洗提取物。
[0103] 在用含lmg/ml或10 μ g/ml阿拉伯樹膠的0.1 M pH 8. 3的碳酸緩沖液包被的96 孔板（Maxisorp，Nunc)的孔中進行第一輪針對阿拉伯樹膠的選擇。4°C過夜進行包被。用 PBS/0. 05%吐溫-20洗滌孔3次，并用含5%脫脂奶粉的PBS (5% MPBS)封閉。在2. 5% MPBS 中重懸噬菌體，對每個孔使用大約2E+llcfu。室溫與孔結(jié)合2小時后，通過用PBS/0. 05% 吐溫-20和PBS大量洗滌去除未結(jié)合的噬菌體。室溫下用含0. lmg/ml胰蛋白酶（Sigma) 的PBS洗脫結(jié)合的噬菌體30分鐘。將洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)移至含有過量AEBSF胰蛋白酶抑制 劑（Sigma)的聚丙烯96孔板（Nunc)。比較靶包被的孔的噬菌體滴度與空白孔的噬菌體滴 度以評估富集度。根據(jù)標準步驟使用新鮮TGl細胞擴增噬菌體。
[0104] 與第一輪選擇相似地進行第二輪選擇，除了對文庫25和30用10 μ g/ml和 0. 1 μ g/ml的阿拉伯樹膠替代lmg/ml和10 μ g/ml的阿拉伯樹膠來包被孔。在第一輪選擇 中文庫27、28、29、31和32沒有獲得顯著的富集。在第二輪選擇中文庫28、31和32富集 >1000倍，而文庫27和29分別富集25倍和250倍。在第一輪選擇中文庫25和30分別富 集50倍和>1000倍。在第二輪選擇中，兩個文庫都富集1000倍。針對馬鈴薯表皮⑶TA提 取物的選擇與針對阿拉伯樹膠的選擇相似地進行，但第一輪和第二輪選擇用10倍和1000 倍稀釋的馬鈴薯表皮CDTA提取物包被孔。第一輪選擇中文庫25、27、28、29、30、31、32分別 富集10、1Ε+03、20、20、>1E+04、15和5倍，而第二輪選擇中所有文庫>100倍。針對小麥表 皮CDTA提取物的選擇與針對馬鈴薯表皮CDTA提取物的選擇相似地進行，但第一輪和第二 輪選擇用20倍和2000倍稀釋的小麥表皮⑶TA提取物包被孔。第一輪選擇中文庫25、27、 28、29、30、31、32 分別富集 >10、>100、>10、1、>1E+03、10 和 5 倍。第二輪選擇中文庫 29 富 集>10倍，文庫25、27、28、30、31、32富集>100倍。針對馬鈴薯葉的選擇在兩輪連續(xù)的選擇 中進行，第一輪中使用葉顆粒而第二輪中使用全葉。文庫27、28、29、30、31和32用于針對葉 的選擇。通過使用Ultra-Turrax T25勾衆(zhòng)器在PBS中攪拌馬鈴薯葉制備用于第一輪選擇的 葉顆粒。通過離心從懸液中收集葉顆粒。上清液，這里稱為"勻質(zhì)化的葉的可溶部分"，預(yù)期 (assumingly)是細胞內(nèi)組分富集的，并在噬菌體選擇期間在溶液中使用以競爭掉胞內(nèi)表位 的結(jié)合子。室溫下在2% MPBS中顛倒旋轉(zhuǎn)30分鐘將文庫噬菌體與勻質(zhì)化的葉的可溶部分 預(yù)孵育。將混合物加入葉顆粒并室溫顛倒旋轉(zhuǎn)孵育2小時。通過離心收集結(jié)合有噬菌體的 葉顆粒，并丟棄上清液。通過連續(xù)用PBS洗滌充分洗滌結(jié)合有噬菌體的葉顆粒。通過在PBS 中重懸葉顆粒、旋轉(zhuǎn)沉降葉顆粒并丟棄上清液進行洗滌。如前述進行噬菌體洗脫和TGl感 染。第二輪選擇使用完整的全葉。葉倒置漂浮于2% MPBS中的噬菌體溶液中孵育，并允許 噬菌體室溫結(jié)合2小時。通過將葉轉(zhuǎn)移至含PBS的新鮮管中充分洗滌葉。用水中IOOmM的 TEA進行結(jié)合的噬菌體的洗脫，并用洗脫的噬菌體一半體積的pH 7. 5的IM Tris中和含洗 脫的噬菌體的溶液。如前述進行TGl感染。
[0105] 從選擇結(jié)果挑取單菌落-從文庫25和30針對阿拉伯樹膠的第一和第二輪選擇中 挑取單個的克隆。在第二輪選擇而不是第一輪選擇之后從文庫27、28、29、31和32針對阿拉 伯樹膠的選擇中挑取克隆。從阿拉伯樹膠的選擇總共挑取208個克隆。在所有文庫的第一 和第二輪選擇之后，從針對馬鈴薯表皮CDTA提取物的選擇中總共挑取321個克隆。在所有 文庫的第二輪選擇之后，從針對小麥表皮CDTA提取物的選擇中總共挑取162個克隆。在文 庫27、28、29、30、31和32第二輪選擇之后，從馬鈴薯葉的選擇中總共挑取184個克隆。用 系列稀釋的洗脫的噬菌體感染新鮮的TGl細胞，并涂布于LB瓊脂；2%葡萄糖；100 μ g/ml 氨芐青霉素上。將單克隆挑取入每孔含100 μ I 2XTY ;10%甘油；2%葡萄糖；100 μ g/ml氨 芐青霉素的96孔板中。37°C孵育平板并儲存于_80°C作為母板（master plate)。
[0106] 實施例2:VHH的鑒定
[0107] 單點結(jié)合ESLISA-使用單點結(jié)合ELISA鑒定與阿拉伯樹膠或植物提取物結(jié)合的 克隆。如下述制備用于ELISA的含VHH的提取物。從母板接種至96孔板（每孔含100 μ 1 2ΧΤΥ、2%葡萄糖、lOOμg/ml氨芐青霉素）并在37°C生長過夜。每孔25μ1的過夜培養(yǎng) 物用于接種至每孔含Iml 2ΧΤΥ ;0. 1%葡萄糖；lOOμg/ml氨芐青霉素的96孔深孔板中。 37°C孵育器搖動生長3小時后，加入IPTG至終濃度ImM，另外孵育4小時期間將產(chǎn)生重組 VHH。通過3, OOOg離心20分鐘旋轉(zhuǎn)沉降細胞并儲存于-20°C過夜。解凍細胞沉淀，簡單振 蕩，每孔加入125 μ 1室溫PBS。在ELISA搖床平臺上室溫15分鐘重懸細胞。將平板3, OOOg 離心20分鐘，每孔100 μ 1含VHH的提取物轉(zhuǎn)移至聚丙烯96孔板（Nunc)并儲存于-20°C直 至進一步使用。
[0108] 在用含lmg/ml阿拉伯樹膠的pH 8. 3的碳酸緩沖液包被的ELISA平板（100 μ 1/ 孔）中分析來自阿拉伯樹膠選擇的克隆的結(jié)合。對馬鈴薯表皮CDTA提取物和小麥表皮 CDTA提取物分析來自馬鈴薯表皮CDTA提取物選擇的克隆的結(jié)合，其使用以100 μ 1/孔的 在0.1 M pH8. 3的碳酸緩沖液中的30倍稀釋的馬鈴薯和30倍稀釋的小麥表皮CDTA提取物 包被的ELISA平板。使用以100 μ 1/孔的0.1 M pH8. 3的碳酸緩沖液中的20倍稀釋的小麥 表皮CDTA提取物包被的ELISA平板分析來自小麥表皮CDTA提取物的選擇的克隆的結(jié)合。 4°C包被過夜并第二天繼續(xù)室溫包被1小時后，用PBS/0. 05%吐溫-20洗滌平板3次，并用 含5%脫脂奶粉的PBS封閉1.5小時。清空平板并每孔加入90 μ 1 1%的MPBS。將來自每 個克隆的10 μ 1含VHH的提取物加入抗原包被的孔和空白孔。使VHH室溫結(jié)合1小時，通 過PBS/0. 05%吐溫-20洗滌3次去除未結(jié)合的VHH。依次與含單克隆小鼠抗組蛋白抗體 (Abd Serotec)的l%MPBS/0. 05%吐溫-20和含與堿性磷酸酶綴合的兔抗鼠 IgG全分子抗 體〇^]\0^)(5丨81^)的1%]\〇^5/〇.〇5%吐溫-2〇孵育檢測結(jié)合的￥冊。通過？85/〇.〇5% 吐溫-20洗滌3次去除未結(jié)合的抗體。用PBS另外洗滌平板2次并每孔加入100 μ I pNPP 二鈉六水化合物底物（Sigma)。
[0109] 測量405nm的吸光度并計算每個克隆與靶包埋的孔和無靶包埋的孔結(jié)合的VHH比 值。23%的克隆具有大于2的比值，首先挑取這些克隆用于更詳細的鑒定。之后再復(fù)查具 有1. 15和2之間的比值的第二組克?。òㄋ锌寺〉?0% )。具小于1. 15比值的克隆 不進一步分析。
[0110] 對來自全葉的選擇的克隆，開發(fā)了修改的ELISA。倒置漂浮的葉盤用于替代用抗原 包埋孔。與提取物ELISA相似地孵育。與底物孵育后，用鑷子從孔中去除葉盤并測量405nm 的吸光度。每個克隆獲得的信號與含沒有與一抗孵育的葉盤的孔獲得的信號相比，計算比 值。從表皮提取物的選擇發(fā)現(xiàn)并鑒定的葉表面結(jié)合抗體用作陽性對照抗體。通過測序進一 步分析具大于1. 5比值的VHH。
[0111] 單菌落PCR和測序-如下述對ELISA陽性克隆進行單菌落PCR和測序。來 自含ELISA陽性的克隆的母板孔的培養(yǎng)物在蒸餾水中稀釋10倍。5 μ 1這些稀釋的克 隆用作PCR模板，其使用正向引物MP57(5' -ttatgcttccggctcgtatg-3'）和反向引物 GIII (5' -ccacagacagccctcatag-3'）。通過 Sanger 測序法測序 PCR 產(chǎn)物，其使用 MP57 引 物（VIB Genetic Service Facility, University of Antwerp，Belgium)〇
[0112] 抗體生產(chǎn)和純化-根據(jù)標準步驟在大腸桿菌抑制株TGl或非抑制株WK6中生產(chǎn) VHH 抗體片段（Fritz 等人，Nucleic Acids Research，Volume 16Number 14 1988)。簡單 地，進行菌落劃線并將單菌落的過夜培養(yǎng)物接種于2 XTY ;2%葡萄糖；100 μ g/ml氨芐青霉 素中。過夜培養(yǎng)物用于1:100在2XTY;0. 1 %葡萄糖；100 μ g/ml氨芐青霉素中接種新鮮 培養(yǎng)物。37°C孵育器搖動生長3小時后，加入IPTG至終濃度ImM，另外孵育4小時期間將 產(chǎn)生重組VHH抗體片段。將細胞旋轉(zhuǎn)沉降并重懸于1/5(^初始培養(yǎng)物體積的周質(zhì)提取緩沖 液（50禮？!17的磷酸；說似(：1;11111^0了4)中，4°〇顛倒旋轉(zhuǎn)孵育過夜。通過3,00(^4°〇離 心20分鐘旋轉(zhuǎn)沉降原生質(zhì)球。將上清液轉(zhuǎn)移至新鮮管中并再次3, OOOg 4°C離心20分鐘。 根據(jù)制造商說明使用l/15th提取物體積的TALON金屬親和樹脂（Clontech)從周質(zhì)提取物 中純化六聚組氨酸標記的VHH抗體片段。根據(jù)制造商說明使用Vivaspin 5k Da MWCO裝置 (Sartorius Stedim)在PBS中濃縮并透析純化的VHH抗體片段。
[0113] 在ELISA中VHH與阿拉伯樹膠結(jié)合-在每孔用100 μ 1含100 μ g/ml阿拉伯樹膠 的50mM pH9. 6的碳酸鹽緩沖液包被的ELISA平板上進行VHH抗體片段的滴定。4°C過夜包 被平板并第二天繼續(xù)室溫包被1小時。用PBS/0. 05%吐溫-20洗滌平板3次并用含5%脫 脂奶粉的PBS封閉1小時。在含1% MPBS/0.0 5%吐溫-20的聚丙烯96孔板中制備4倍系 列稀釋的純化的VHH抗體片段。抗體濃度范圍從3 μ g/ml至12ng/ml。將抗體稀釋液轉(zhuǎn)移 至阿拉伯樹膠包被的平板并使VHH抗體片段室溫結(jié)合1小時。依次與單克隆小鼠抗組蛋白 抗體（Abd Serotec)和含與堿性磷酸酶綴合的兔抗鼠 IgG全分子抗體（RaM/AP) (Sigma)的 1 % MPBS/0. 05 %吐溫-20孵育檢測結(jié)合的VHH。每次抗體孵育后用PBS/0. 05 %吐溫-20洗 滌3次去除未結(jié)合的抗體。用PBS另外洗滌平板2次并每孔加入100 μ I pNPP二鈉六水化 合物底物（Sigma)。測量405nm的吸光度并繪制為抗體濃度的函數(shù)（見表1)。
[0114] 表 1 :
[0115]
[0117] 在ELISA中VHH與馬鈴薯凝結(jié)素結(jié)合
[0118] 每孔用100 μ 1含100 μ g/ml馬鈴薯凝集素（Sigma)的PBS 4°C過夜包被ELISA 平板（1&?丨8〇印，燦11(3)并第二天繼續(xù)室溫包被1小時。用？83/0.05%吐溫-20洗滌平板 3次并用含5%脫脂奶粉的PBS封閉1小時。將VHH(3 μ g/ml)轉(zhuǎn)移至馬鈴薯凝集素包被的 平板并使VHH抗體片段室溫結(jié)合1小時。依次與單克隆小鼠抗組蛋白抗體（Abd Serotec) 和含與堿性磷酸酶綴合的兔抗鼠186全分子抗體（1^10^)(5丨8111&)的1%1〇^5/〇.〇5%吐 溫-20孵育檢測結(jié)合的VHH。每次抗體孵育后用PBS/0. 05%吐溫-20洗滌3次去除未結(jié)合 的抗體。用PBS另外洗滌平板2次并每孔加入100 μ I pNPP二鈉六水化合物底物（Sigma)， 測量405nm的吸光度（見表2)。
[0119] 表2:
[0120]
[0121] 實施例3 :結(jié)合結(jié)構(gòu)域與植物表面的結(jié)合
[0122] VHH與葉盤結(jié)合-研宄了 VHH與馬鈴薯（D6sir6e品種）、龍葵、禾本科植物、小麥 或杜醒未固定的葉盤的結(jié)合。平行分析了 CBM3a與未固定的馬鈴薯（D6sir6e品種）葉盤 的結(jié)合用于比較。通過用5_的皮帶打孔工具穿孔新鮮馬鈴薯葉制備葉盤。立即將葉盤放 入每孔含200 μ 1 5%的MPBS或PBS的96孔板的孔中并孵育30分鐘。將葉盤分別轉(zhuǎn)移至 含5 μ g/ml VHH抗體片段的2% MPBS或含5 μ g/m CBM3a的PBS的溶液中并孵育60-90分 鐘。通過用2 % MPBS或PBS洗滌3次去除未結(jié)合的VHH或CBM3a蛋白質(zhì)。在1 % MPBS中 與直接綴合于Alexa-488熒光染料（Abd Serotec)的單克隆小鼠抗組氨酸抗體孵育1小時 來檢測結(jié)合的VHH或CBM3a蛋白質(zhì)。用PBS洗滌3次去除未結(jié)合的抗體。將葉盤放置于玻 璃載玻片上，蓋上蓋玻片，并用顯微鏡或在大變焦顯微鏡系統(tǒng)（Nikon)或SP5共聚焦顯微鏡 系統(tǒng)（Leica)上分析。通過非限制性的實例，發(fā)現(xiàn)VHH抗體片段（例如3E6JD4)明確地與 馬鈴薯葉的葉表面上的表皮毛、氣孔和角質(zhì)層結(jié)合（圖1A-C)。與此形成鮮明對比的是，在 馬鈴薯葉表面沒有檢測到CBM3a的結(jié)合，而在馬鈴薯葉盤的切割邊緣僅觀察到與受傷組織 的微弱的結(jié)合（圖1D)。一些本發(fā)明的VHH(例如3E6)還顯示出對龍葵葉或禾本科植物葉 表面的特異性結(jié)合，如圖IF和IG中分別所示。沒有觀察到對小麥或杜鵑葉表面的顯著結(jié) 合。
[0123] VHH與完整活植物的結(jié)合-在盆栽馬鈴薯植物上（DeSir6e品種）研宄了 VHH與完 整活植物的結(jié)合。將完整活植物的復(fù)葉浸沒入含六聚組氨酸標記的VHH的PBS溶液中，或 單獨