一種用于修復(fù)石油烴污染鹽堿化土壤的微生物固定化菌劑及制備方法
【專利說明】一種用于修復(fù)石油烴污染鹽堿化土壤的微生物固定化菌劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)石油烴污染鹽堿化土壤的微生物固定化菌劑及制備方法，具體涉及一種將篩選得到的高效石油烴降解菌固定化并應(yīng)用于修復(fù)鹽堿性石油污染環(huán)境的技術(shù)方法，其屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在石油開采和油井施工作業(yè)過程中，易造成石油泄漏，污染土壤。我國大港油田、大慶油田、勝利油田等多個油田的土壤因其特定的地質(zhì)條件和不合理的人類活動均有不同程度的鹽堿化。鹽堿土壤本身理化性質(zhì)差，石油污染進(jìn)一步惡化了其理化性質(zhì)，對土壤微生物造成顯著脅迫，干擾土壤物質(zhì)循環(huán)。此外，石油中含有的多環(huán)芳烴等污染物具有“三致”效應(yīng)，具有較高的生態(tài)風(fēng)險，對人類健康具有潛在威脅。因此，石油污染鹽堿土壤的修復(fù)是一項緊迫任務(wù)。然而目前的土壤修復(fù)方法大多集中在石油或者鹽堿單一脅迫方面，針對石油和鹽堿復(fù)合脅迫下的土壤修復(fù)制劑罕見報道。
[0003]目前，石油污染土壤的修復(fù)方法主要有:萃取、淋洗、堆肥、植物修復(fù)、微生物修復(fù)等。微生物由于具有繁殖能力強、適應(yīng)性強、降解譜廣等優(yōu)點，常用于清除石油類污染物。從石油污染土壤中分離高效石油烴降解菌，特別是適應(yīng)特定土壤環(huán)境的降解菌，仍是石油污染土壤修復(fù)的研宄熱點之一。通常情況下，石油烴降解菌不太適應(yīng)鹽堿性土壤環(huán)境，鹽堿脅迫影響其生長活性劑其降解效果的發(fā)揮。從石油污染鹽堿土壤中分離得到的耐鹽堿石油烴降解菌能夠較好地適應(yīng)鹽堿土壤環(huán)境，可以在高鹽堿條件下高效地降解石油烴。
[0004]微生物修復(fù)在實施過程中也存在著一定的難度。例如，由于石油烴組成復(fù)雜，毒性強，且生物可用性降低等原因使原位生物強化修復(fù)的效率低。同時外來菌種受生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境因素的復(fù)雜性和波動性的沖擊，接種微生物數(shù)量和活性迅速降低至無法達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，外源微生物的生存能力、活性以及迀移能力與環(huán)境因素之間的關(guān)系直接決定著生物強化修復(fù)的治理效果。就修復(fù)高鹽堿石油污染土壤而言，固定化微生物技術(shù)比游離微生物具有明顯的優(yōu)勢，固定化菌劑能夠較好地彌補游離細(xì)菌生存能力差的缺點，固定化載體還可以作為一種膨松劑，有利于氧氣的傳遞，用生物炭作載體來修復(fù)石油污染土壤具有重要研宄意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1.一種用于修復(fù)石油烴污染鹽堿化土壤的微生物固定化菌劑及制備方法，其特征在于，其步驟如下:
[0006]I)菌懸液的制備:將在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的HRJ4菌液離心，棄去上清液，并用無菌水沖洗兩次，以保證菌液中不含其它碳源，后重懸于等量無菌水中得到菌懸液；
[0007]2)生物炭的制備:將木肩洗凈晾干之后粉碎，在馬弗爐中700°C條件下缺氧裂解，得到700°C的生物炭，標(biāo)記為BC(B1char)。將BC過50目篩備用；
[0008]3)將BC和菌懸液按照5: 100 (w/v)的比例混合兩小時，使細(xì)菌吸附在BC表面或進(jìn)入BC的孔隙中，這樣我們就得到了 B-BC(Bacteria-B1char)；
[0009]4)然后向B-BC混合溶液中添加2% (w/v)的海藻酸鈉，這樣就得到了海藻酸鈉、生物炭吸附載體、細(xì)菌混合懸濁物。將該懸濁物逐滴滴加到滅過菌的2% (w/v)CaCl2溶液中，靜置30min，制成直徑3?5_可沉降的固定化菌球，將該小球命名為B-BC-SA ；
[0010]5)固定化小球需要在CaCl2溶液中交聯(lián)16h以增加其硬度。最后用紗布將小球撈出，并用無菌水沖洗，并4°C保存在無菌生理鹽水中；
[0011]6)降解率測定:將適量石油烴加入無機鹽培養(yǎng)基(M9MM)中，滅菌之后接種菌液，在150rpm，30°C條件下培養(yǎng)7天。降解完成之后的樣品用1:1H2SO4酸化至PH為2，加入Ig NaCl (25ml體系)破乳化作用，然后加入20ml 二氯甲燒60w條件下超聲萃取15min，用分液漏斗將水相和有機相分離，剩余水相中再添加20ml 二氯甲烷，重復(fù)上述超聲萃取過程，此過程進(jìn)行三次，收集有機相，無水硫酸鈉脫水，40°C旋蒸蒸干，并用色譜純二氯甲烷定容。樣品制備完成之后，用配備有HP-5毛細(xì)管柱(30mX0.32mmX0.25um)，F(xiàn)ID檢測器的氣象色譜儀來檢測，計算降解率。
[0012]2.
【發(fā)明內(nèi)容】
I所述的微生物固定化菌劑，其特征在于，選用的菌種于2014年12月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編:100101 ;具體為:變異棒桿菌(Corynebacterium variabile) HRJ4 (保藏編號 CGMCC N0.10134)，該菌株具有較好的耐鹽堿及石油烴降解能力，圖1為HRJ4在不同鹽度和PH條件下在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h之后的OD值，圖2為HRJ4在PH為9，鹽度為3%條件下培養(yǎng)7d之后培養(yǎng)基中剩余的石油烴含量。
[0013]3.
【發(fā)明內(nèi)容】
I第六步中所述的無機鹽培養(yǎng)基(M9MM)，其特征在于，無機鹽培養(yǎng)基成分為(IL):8.5g Na2HPO4.2Η20，3.0g KH2PO4,1.0g NH4Cl,0.49gMgS04.7Η20，0.0llgCaCl2, NaCl 的量根據(jù)需要加入。微量元素:0.4mg CuSO4,1.0mg KI,4.0mg MnS04.H20，4.0mg ZnS04.7H20，5.0mg H3B03，1.6mgH2Mo04.2H20，2.0mg FeCl3.6H20。其中 lmol/1 的MgSO4.7H20和lmol/1的CaCl2*開滅菌之后再加入培養(yǎng)基中，鹽度為3%，PH為9。
[0014]4.
【發(fā)明內(nèi)容】
I第六步中所述的GC檢測條件如下:氮氣作為載氣；不分流模式；進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度都為300°C;柱箱溫度為:40°C保持0.5min，以每分鐘15°C的速度升至290 °C并保持5min。
[0015]5.該微生物菌劑制備簡單并有較好的穩(wěn)定性。采用本微生物菌劑處理石油污染鹽堿土壤具有處理成本低、利于石油專性降解菌適應(yīng)新的污染環(huán)境、提高和改善土壤的微生態(tài)環(huán)境質(zhì)量和對環(huán)境不造成二次污染的優(yōu)點，可以顯著地提高鹽堿土壤中石油烴的降解效率，同時也可適用于有一定含鹽量的石油污染水體的修復(fù)。
[0016]說明書附圖:
[0017]圖1是菌B05(HRJ4)在不同鹽度和PH條件下在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h之后的OD值圖；
[0018]圖2是菌B05 (HRJ4)對各種烴類的降解效果圖；
[0019]圖3是制備得到的固定化小球(左:B-BC-SA ;右:B-ffC-SA)圖；
[0020]圖4是生物炭、木肩以及各種固定化囷劑的掃描電鏡結(jié)果(A:生物炭；B:木肩；C:生物炭吸附細(xì)菌；D:木肩吸附細(xì)菌；E:B-BC-SA ；F:B-ffC-SA)圖；
[0021]圖5是各實驗組和對照組對混合烴中每種組分的降解結(jié)果圖。
【具體實施方式】
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[0022]結(jié)合以下具體實施案例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。需理解，以下實施方式僅用于解釋本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的適用范圍。下列實施方式中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作。
[0023]實施例:
[0024]將石油徑降解菌變異棒桿菌(Corynebacterium variabile) B05 (HRJ4)(保藏編號CGMCC N0.10134)進(jìn)行固定化，所述固定化選用生物炭和海藻酸鈉為固定化載體，石油徑降解菌培養(yǎng)液(B)、700°C下制備的生物炭(BC)和海藻酸鈉(SA)的比例為100: 5: 2。首先，將培養(yǎng)至對數(shù)期的變異棒桿菌(Corynebacterium vari