0);使用計(jì)算機(jī)程序Microsoft Excel和 GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，并計(jì)算出各試驗(yàn)藥物的EC50。
[0107] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1各藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)的總蛋白濃度（mg/ml) 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒的可靠定量范圍是1 一 50 μ g，在此范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品BSA 與吸光值成濃度依賴關(guān)系，擬和曲線為y=a+bx+cx~2,其中，a、b、c為常數(shù)，a=0. 54543092， b=-0. 028833977, c=0. 00059713018,相關(guān)系數(shù)r大于0.99,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖11。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線和待定量的蛋白質(zhì)樣品溶液的480nm吸收值計(jì)算出各樣品的總蛋白濃度，如表1。
[0108] 表1各組樣品的總蛋白濃度（mg/ml)
2、各藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度檢測結(jié)果： I) cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線 在Mouse/Rat cAMP Assay kit的可靠定量范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品cAMP與吸光值成濃度依賴 關(guān)系，擬和曲線為 y=(a+bx)~(-l/c)，其中，a、b、c 為常數(shù)，a= 3. 202598，b= 0· 18163734，c= I. 5075207,相關(guān)系數(shù)r大于0. 99,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖12。
[0109] 各藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度 試驗(yàn)藥物 PP〇lb、ppOlc、Exendin-4 被稀釋成 5 個(gè)梯度濃度（ΚΓ1(Ι、10-9、10-8、ΚΓ7、KT 6 mol/L)與IBMX (100 μ mol/L)共孵育PC12細(xì)胞30min，各試驗(yàn)藥物的生物活性如表2所示。
[0110] 表2各藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度（X土s)pmol/mL (n=3 in each group)
P是樣品組與control組相比較的值。
[0111] 由上表2數(shù)據(jù)可以看出，在KTic^KT6 mol/L藥物濃度范圍內(nèi)，各試驗(yàn)藥物的濃度 與cAMP的量呈濃度依賴關(guān)系。當(dāng)試驗(yàn)藥物濃度在10_9~10_ 6 mol/L范圍內(nèi)，樣品組細(xì)胞內(nèi) cAMP的量與空白對照組（control)的比較具有顯著性差異（p < 0. 05)。相同濃度條件下， 當(dāng)試驗(yàn)藥物的濃度增加到一定程度，細(xì)胞內(nèi)cAMP的量不再增加，這可能是由于試驗(yàn)藥物與 PC12細(xì)胞的GLP-I受體的結(jié)合已達(dá)到飽和。
[0112] 另，將cAMP的濃度換算成相當(dāng)于總蛋白的含量，如表3所示。
[0113] 表3各藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度（X土s)pmol/mg (n=3 in each group)
P是樣品組與control組相比較的值。
[0114] 由表3所示數(shù)據(jù)，可以看出，ppOlb刺激細(xì)胞產(chǎn)生的最大cAMP的量是 73. 312±4· 407pmol/mg，pp01c 刺激細(xì)胞產(chǎn)生的最大 cAMP 的量是 109. 021±4· 387pmol/mg， Exendin-4刺激細(xì)胞產(chǎn)生的最大cAMP的量是68. 629±8. 416pmol/mg。說明在Exendin-4 C 末端進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到的本發(fā)明所提供的化合物生物活性優(yōu)于Exendin-4。
[0115] 試驗(yàn)藥物刺激PCl2細(xì)胞產(chǎn)生cAMP的量效關(guān)系 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行制圖并計(jì)算藥物的半效反應(yīng)劑量（EC50)，如圖13所 示。ppOlb 的 EC50 是 5. 098nmol/L，ppOlc 的 EC50 是 7. 210nmol/L，Exendin-4 的 EC50 是 5.096nmol/L〇
[0116] 試驗(yàn)實(shí)施例2 ppOlb和ppOlc降血糖實(shí)驗(yàn) 以本發(fā)明提供的化合物PP〇lb、ppOlc和ppOlk為例，說明本發(fā)明提供化合物體內(nèi)活 性： 以本發(fā)明提供的化合物PP〇lb、ppOlc和ppOlk作為實(shí)驗(yàn)藥物，以艾塞那肽和生理鹽水 做對照，將生理狀態(tài)相同的雄性大鼠，分為5組(每組4只)，禁食24h，在五組大鼠腹腔同時(shí) 注射葡萄糖（20mmol/kg，體重)，然后分別按照以下處理： 實(shí)驗(yàn)組：注射分別注射 ppOlb (10nmol/kg)、pp01c (10nmol/kg)、pp01k (10nmol/kg); 對照組1 :注射艾塞那肽(與實(shí)驗(yàn)組相同劑量）； 對照組2 :注射生理鹽水（體積與實(shí)驗(yàn)組相同）。注射后于0、15min、30min、60min、 240min、480min尾靜脈采血，用葡萄糖氧化酶法（GOD法）檢驗(yàn)血液中葡萄糖含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如下表4所示： 表4
從表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，艾塞那肽在約0. 5時(shí)達(dá)到穩(wěn)定降糖效果，與生理鹽水相比，血糖約 降低16% ;本發(fā)明提供的化合物pp01b、pp01c和ppOlk約在0· 5h時(shí)也實(shí)現(xiàn)了相應(yīng)的降糖作 用，并且均在約I. 5h時(shí)候，達(dá)到了最為顯著的降糖效應(yīng)，和生理鹽水組相比較，血糖約降低 了 70%，并且降糖效應(yīng)可維持超過8h。
[0117] 通過胰島素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢驗(yàn)血液中的胰島素含量，檢測結(jié)果如表5所示： 表5
有胰島素含量檢測結(jié)果可看出，艾塞那肽在大鼠血液中的胰島素含量在約〇.5h后達(dá) 到峰值，而化合物PP〇lb、ppOlc和ppOlk均在約I. 5h后實(shí)現(xiàn)血液中胰島素的峰值。
[0118] 按小時(shí)抽取實(shí)驗(yàn)小鼠血液，檢測其中艾塞那肽含量，經(jīng)測定，pp01b、pp01c和 PPOlk在大鼠體內(nèi)的半衰期與艾塞那肽相比顯著延長。
[0119] 本發(fā)明提供的艾塞那肽衍生物具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，能顯著降低血糖，具 有與艾塞那肽相當(dāng)或更優(yōu)的生物學(xué)活性。并且本發(fā)明提供的艾塞那肽衍生物顯著延長了半 衰期，并且體內(nèi)穩(wěn)定性大大優(yōu)于艾塞那肽，降糖效果更加明顯。
[0120] 應(yīng)當(dāng)說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本 發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行任 何修改，或?qū)ζ渲胁糠旨夹g(shù)特征進(jìn)行等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 化合物：D-A-P-L 其中D為GLP-1類似物部分； A具有如下的結(jié)構(gòu)：-NRi-X-NR^， 其中，&、R2獨(dú)立的選自H和k的烷基； X選自： (1) _(CH2)n_，其中n為2~10的整數(shù)； (2) -[ (CH2)nZ]p(CH2)n-，其中Z為0、NR3或S，n獨(dú)立的選自f10的整數(shù)，p為(T10的 整數(shù)，其中R3為H或(^6的烷基； (3) 氨基酸殘基或被一種或多種取代基取代的氨基酸殘基，所述取代基選自H，(V6的烷 基、羰基和_NR2R3，其中，R2、R3獨(dú)立的選自H和Cm的烷基； (4) -(CH2)nC(0)Z(CH2)n-，其中Z為0或單鍵，n獨(dú)立的選自廣10的整數(shù)； 和 (5) (^_1(|的亞烷基，并且，所述亞烷基中的H被一種或多種下列取代基取代，所述取代基選自 _C4的直鏈或支鏈烷基、鹵素、NHR5、CN、羧基、硝基和的烷基醇； 其中，％Au&q 的直鏈或支鏈烷基； P為含有寡聚乙二醇類的連接部分，L是親脂性連接部分； 并且，D的末端氨基酸殘基的碳端與A的N&通過酰胺鍵連接，A的NR2與P通過酰胺 鍵連接，P與L通過酰胺鍵連接。2. 如權(quán)利要求1所述化合物，其中，P是具有如下結(jié)構(gòu)的部分：L具有如下結(jié)構(gòu)：其中，m是廣20的整數(shù)；k是6~20的整數(shù)；波浪線"！ "表示連接位點(diǎn)。3. 如權(quán)利要求1所述化合物，其中，A具有如下結(jié)構(gòu)：4. 如權(quán)利要求1所述化合物，具有如下結(jié)構(gòu)：5. 如權(quán)利要求4所述的化合物，其中，GLP-1類似物選自以下：GLP-1 (7-35)、 GLP-1 (7-36)、GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-38)、GLP-1 (7-39)、GLP-1 (7-40)、GLP-1 (7-41)、 GLP-1 (7-42)、GLP-1 (7-43)、GLP-1 (7-44)、GLP-1 (7-45)、GLP-1 (7-46)或其類似物。6. 如權(quán)利要求5所述的化合物，其中，GLP-1類似物為包含以下氨基酸序列的肽：aa7-aa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-aal6-Ser-aal8-aal9-aa2〇-Glu-aa22-aa23-Ala-aa2 5-aa26-aa27-Phe-Ile-aa30-Trp-Leu-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-aa38-aa39_aa40-aa41 -aa42-aa43-aa44-aa45_aa46 ; 其中，aa7是L-His、D-His、2_氨基組氨酸、組氨酸或a-甲基組氨酸； aa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、l_氨基環(huán)丙基羧酸、1-氨基環(huán)丁基羧酸、1-氨 基環(huán)戊基羧酸或1-氨基環(huán)庚基羧酸；aal6是Val或Leu;aal8是Ser、Lys或Arg;aal9是 Tyr或Gin;aa20 是Leu或Met;aa22 是Gly、Glu或Aib;aa23 是Gln、Glu、Lys或Arg;aa25 是Ala或Val;aa26 是Lys、Glu或Arg;aa27 是Glu或Leu;aa30 是Ala、Glu或Arg;aa33 是Val或Lys;aa34 為Lys、Asn、Glu或Arg;aa35 是Gly或Aib;aa36 是Lys、Gly或Arg; aa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、氨基或不存在；aa38是Lys、Ser、氨基或不存在；aa39是 Ser、Lys、氨基或不存在；aa40是Gly、氨基或不存在；aa41是Ala、氨基或不存在；aa42是 Pro氨基或不存在；aa43是Pro氨基或不存在；aa44是Pro氨基或不存在；aa45是Ser、氨基 或不存在；3346是氨基或不存在，并且，當(dāng)3337、3338、3339、3&4〇3341、3342、3343、3&44、 aa45或aa46不存在時(shí)，相應(yīng)的其后的氨基酸也不存在。7. 如權(quán)利要求6所述化合物，其中，GLP-1類似物選自： Arg34GLP-l(7-37) ,Lys38Arg26>34GLP-1 (7-38) ,Lys38Arg26>34GLP-1 (7-37) -OH,Lys36Arg26'34GLP-l(7-36)、Aib8'22'35GLP-l(7-37)、Aib8'35GLP-l(7-37)、 Aib8'22GLP-l(7-37)、Aib8'22'35Arg26'34GLP-l(7-38)、Aib8'35Arg26'34Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8'22Arg26'34Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'22'35Arg26Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8Arg26Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'35Arg26Lys38GLP-l(7-38)、Aib22Arg26Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8'22'35Arg34Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'35Arg34Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8'22'35Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'35Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8' 35Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'22Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'22'35Lys37GLP-l(7-38)、 Aib8'35Lys37GLP-l(7-38)和Aib8'22Lys37GLP-l(7-38)。8. 如權(quán)利要求5所述化合物，其中，GLP-1類似物為Exendin-3、Exendin-4或其衍生 物。9. 權(quán)利要求4所述的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)：、、 、 CN104945499A _權(quán)利要求書_ _4/4頁波浪線"I"表示連接位點(diǎn)。10. -種藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述化合物，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)修飾的GLP-1類似物及其制備方法，具體涉及艾塞那肽衍生物及其制備方法；和含有它們的藥物組合物及其在治療疾病如II型糖尿病中的用途。本發(fā)明所提供的艾塞那肽衍生物是在艾塞那肽C末端進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，制備得到化合物能顯著提供細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，并且，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的艾塞那肽衍生物具有與艾塞那肽相當(dāng)甚者更優(yōu)的生物活性，同時(shí)，本發(fā)明所提供的化合物與艾塞那肽相比，穩(wěn)定性好，體內(nèi)半衰期顯著延長。
【IPC分類】A61K38/26, A61K47/48, C07K14/605, A61P3/10
【公開號】CN104945499
【申請?zhí)枴緾N201410124461
【發(fā)明人】袁建棟, 黃仰青, 宋云松, 顧家寧, 楊晴鋮, 朱銳, 季南南, 方程, 姚翠萍
【申請人】博瑞生物醫(yī)藥技術(shù)(蘇州)有限公司
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2014年3月31日
【公告號】WO2015149627A1