一種石斛dna指紋圖譜及其專用引物和建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物DNA指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種石斛DNA指紋圖譜及其專 用引物和建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石斛屬（Dendrobium)是蘭科中最大的一個(gè)屬。我國(guó)目前廣泛種植的石斛屬植物 有金釵石斛、霍山石斛、鐵皮石斛等。尤其是鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)由于具有益胃生津、滋陰清熱等功效（中國(guó)藥典（2010年）），種植面積在我國(guó)發(fā)展很 快。生產(chǎn)上多以味甘、質(zhì)重、柔韌、粘性強(qiáng)等外觀形態(tài)來(lái)評(píng)價(jià)鐵皮石斛的質(zhì)量。目前鐵皮石斛 價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上鐵皮石斛品種繁多，不同品種間莖葉顏色存在差異，多糖含量、甘露糖含 量、生物堿等功能成分含量高低不一，抗病性也存在較大差異。僅僅通過(guò)外觀形態(tài)鑒別，很 容易以次充好，消費(fèi)者往往很難鑒別。因此，準(zhǔn)確鑒別石斛品種真?zhèn)螌?duì)其生產(chǎn)有重大意義。 另外，對(duì)種植者來(lái)說(shuō)選擇一種優(yōu)良品種，有助于獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] G. Li 等在《Theoretical and Applied Genetics》（《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》）2001 年第 103 期 455-461 頁(yè)發(fā)表了題為《Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica》（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，一種新的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)及其在 蕓薹屬作圖和基因標(biāo)簽法上的應(yīng)用）一文。文中評(píng)述SRAP是一種新型的基于PCR的標(biāo)記 系統(tǒng)，它的正向引物含有一段14個(gè)堿基的核心序列，5'端前10個(gè)堿基是無(wú)任何堿基特異構(gòu) 成的填充序列，接著為CCGG序列，該序列可特異結(jié)合開放閱讀框（ORF)區(qū)域中的外顯子，其 后為3'端的3個(gè)選擇性堿基；反向引物與正向引物的堿基組成不同在于填充序列后為AATT 序列，該序列可特異結(jié)合啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域，其擴(kuò)增產(chǎn)物多位于外顯子區(qū)域。SRAP技術(shù)由 于具有簡(jiǎn)便、可靠、易于分離條帶和測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于甘藍(lán)、西萌蘆、茄子等蔬菜和棉 花等作物品種鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建。然而還未見該技術(shù)在石斛指紋圖譜建立中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是，提供一種石斛NDA指紋圖譜及其專用引物和建立方法。
[0005] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種獲取石斛DNA指紋圖譜的專用引物，其核苷酸序列如序列表所示，所述專用 引物選自以下引物對(duì)中的一對(duì)或多對(duì)：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 7 ;SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 8 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 5 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 6 ;SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。所述 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 8 分別對(duì)應(yīng)序列表 中的序列1-序列8。
[0007] 進(jìn)一步地，一種獲取石斛DNA指紋圖譜的專用引物，所述專用引物由序列表中的 以下 6 對(duì)引物組成：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 7 ;SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 5 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 6 ; SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 8 ; SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。
[0008] 具體地，所述專用引物由以下6對(duì)引物（引物序列均為5' -3'）組成：
[0009] (I)TGAGTCCAAACCGGATA 和 GACTGCGTACGAATTCAA ;
[0010] (2)TGAGTCCAAACCGGATA 和 GACTGCGTACGAATTCAG ;
[0011] (3)TGAGTCCAAACCGGAAT 和 GACTGCGTACGAATTGAC ;
[0012] (4)TGAGTCCAAACCGGAAT 和 GACTGCGTACGAATTAAC ;
[0013] (5)TGAGTCCTTTCCGGTGC 和 GACTGCGTACGAATTCAG ;
[0014] (6)TGAGTCCAAACCGGTAG 和 GACTGCGTACGAATTGAC。
[0015] 優(yōu)選地，所述專用引物獲取DNA指紋圖譜的石斛品種為霍山石斛和鐵皮石斛。
[0016] 本發(fā)明還提供一種石斛DNA指紋圖譜的建立方法，該方法包括如下步驟：
[0017] 步驟1，提取石斛材料的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求1-2中任一所述專用引 物進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增；
[0018] 步驟2,將前述步驟中得到的SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳， 用銀染顯示DNA條帶，獲得石斛DNA指紋圖譜。
[0019] 本發(fā)明還提供了利用上述指紋圖譜建立方法獲得的石斛DNA指紋圖譜。所述石斛 DNA指紋圖譜由"0"和"1"組成的一串有序數(shù)字表示，具體為：01100000000,01000000000， 00000110101，00000100101，00010111001，10010011000,00010110001，00001101100， 00000100001,00010101100,00010110000,00000101101，00001110100,00000101100， 00010110100,00000100000,00010100000,00010100010 及 00000001000。其中數(shù)字" 1"表示 圖譜中確定位置上存在擴(kuò)增條帶，"0"表示圖譜中該位置上沒有擴(kuò)增條帶存在。轉(zhuǎn)換成了數(shù) 碼形式，便于計(jì)算機(jī)識(shí)別和分析。上述19串?dāng)?shù)字分別對(duì)應(yīng)2種霍山石斛和17種鐵皮石斛的 DNA指紋圖譜。其中，每串有序數(shù)字具有11個(gè)數(shù)位，從第1數(shù)位到第11數(shù)位對(duì)應(yīng)的引物對(duì) 以及特征條帶為：第1數(shù)位表示ME8和M14引物對(duì)，特征條帶為180bp ;第2數(shù)位表示ME8 和EM14引物對(duì)，特征條帶為190bp ;第3數(shù)位表示ME8和EM14引物對(duì)，特征條帶為240bp ; 第4數(shù)位表示ME9和EM3引物對(duì)，特征條帶為250bp ;第5數(shù)位表示ME9和EM3引物對(duì)，特 征條帶為260bp ;第6數(shù)位表示MEl和EM7引物對(duì)，特征條帶為220bp ;第7數(shù)位表示MEl和 EM7引物對(duì)，特征條帶為HObp ;第8數(shù)位表示MEl和EM14引物對(duì)，特征條帶為170bp ;第9 數(shù)位表示MEl和HM14引物對(duì)，特征條帶為250bp ;第10數(shù)位表示ME3和HM3引物對(duì)，特征 條帶為150bp ;第11數(shù)位表示ME3和EM5引物對(duì)，特征條帶為150bp。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述任一專用引物在獲取石斛DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0022] 1、本發(fā)明利用SRAP分子標(biāo)記來(lái)鑒定石斛品種，通過(guò)構(gòu)建基于每個(gè)石斛品種的 SRAP分子標(biāo)記指紋圖譜，為種植者提供參考。能從遺傳本質(zhì)上對(duì)石斛品系進(jìn)行種質(zhì)鑒定，準(zhǔn) 確、可靠。
[0023] 2、當(dāng)石斛指紋圖譜一旦建立以后，在對(duì)某個(gè)未知樣品進(jìn)行真實(shí)檢測(cè)時(shí)，幾個(gè)小時(shí) 就可以知道該石斛DNA指紋，因此可以迅速判斷出石斛品種的真實(shí)性。
[0024] 3、采用該發(fā)明，構(gòu)建該DNA指紋圖譜所用的樣品可以根據(jù)需要不斷增加，并對(duì)指 紋進(jìn)行實(shí)時(shí)更新。
[0025] 4、本發(fā)明采用表的形式來(lái)說(shuō)明DNA指紋圖譜，并將其轉(zhuǎn)換成了數(shù)碼形式，便于計(jì) 算機(jī)識(shí)別和分析。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中引物對(duì)ME8和EM14在20份石斛材料中的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下采用的試劑和生物材料 如未特別說(shuō)明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 本實(shí)施例采用收集到的20份具有廣泛代表性的石斛品系為供試材料，用組培苗 提取DNA，進(jìn)行SRAP分析，建立與之相對(duì)應(yīng)的指紋圖譜。得到的指紋圖譜再用于對(duì)這20種 石斛品種進(jìn)行鑒定，并為其它石斛的種質(zhì)鑒定提供一條可供借鑒的有效方法。建立石斛DNA 指紋圖譜的具體操作如下：
[0030] 1、選用代表性石斛品種
[0031 ] 本實(shí)施例采用表2所示20份石斛品種，其中金釵石斛（Dendrobium nobiIe Lindl.)1 份，霍山石斛（Dendrobium huoshanense)1 份，鐵皮石斛（Dendrobium officinale) 18份，