M培養(yǎng)基中DBP的含量提 高100mg/L)。然后將轉(zhuǎn)接10次的培養(yǎng)液稀釋IO 3~10 5涂布于LB固體平板上，30°C倒置 培養(yǎng)1~3天。待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細(xì)菌，編 號(hào)為2D。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)。LB平板 培養(yǎng)7天的菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕潤(rùn)，易被挑起，邊緣較薄(見圖1 )。
[0027] 掃描電鏡樣品制備與觀察：將菌種2D的單菌落接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基 過夜活化。吸取800 μ L菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS 洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL 2.5% (v/v)戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然 后再次經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。隨后將菌體 分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個(gè)梯度約浸泡15 min，然 后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脫 水。菌體經(jīng)過〇)2干燥后制片觀察。掃描電鏡下可以觀察到該菌呈長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)約1.5~3.0 μπι，寬約 0.5 ~0.8 μπι (見圖 2)。
[0028] 菌株的生理生化鑒定指標(biāo)包括12項(xiàng)：甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、檸檬酸鹽 利用、肌醇產(chǎn)酸試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還 原、氧化酶試驗(yàn)和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0029] 菌株的16S rDNA鑒定：提取細(xì)菌總DNA，用細(xì)菌16S rDNA通用引物對(duì)該菌基因組 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序（由上海生工完成）后，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的 16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并選取若干菌種做進(jìn)化樹分析。如圖3所示，本發(fā)明分離純 化得到的菌株2D的16S rDNA序列與普羅威登斯菌，菌種保藏號(hào)為 NBRC 12930)同源率達(dá)99%，進(jìn)化距離最近。與該菌屬其他菌種也有較高同源性。因此，本 發(fā)明篩選獲得的菌株鑒定為普羅威登斯菌屬，命名為2D。
[0030] 實(shí)施例2D對(duì)DBP及其中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸的降解實(shí)驗(yàn) 1、菌懸液制備 將純化后的菌種2D接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化培養(yǎng) 至對(duì)數(shù)期，經(jīng)5000 rpm離心10 min收集菌體，用PBS洗菌3次后重懸，調(diào)節(jié)OD6tltl M = 0.8 作為菌種懸液。
[0031] 2、降解能力測(cè)定 分別向含有不同濃度DBP (50、100、200、500、1000 mg/L)和鄰苯二甲酸（25、50、100、 200、500 mg/L)的 MSM 培養(yǎng)液(無機(jī)鹽培養(yǎng)液 g/L !typers· 8 ;ΚΗ2Ρ04:4· 5 ; (NH4)2S04:2. 0 ; MgCl2:0. 16 ;CaCl 2:0· 02 ;Na2Mo04 ·2Η20 :0· 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl 2 ·2Η20 :0· 0015)中接 菌I mL，以不接菌作為對(duì)照，并調(diào)節(jié)pH為8.0,每組三個(gè)重復(fù)。在30°C，140 rpm恒溫?fù)u床 培養(yǎng)6天，定期取樣，經(jīng)GC/MS測(cè)定DBP及鄰苯二甲酸的降解情況。
[0032] 色譜條件：采用島津公司QP2010 Plus型GC/MS串聯(lián)質(zhì)譜儀。色譜柱為安捷倫HP-5 柱子（0.25 μπι X 0. 25 mm X 30 m)，進(jìn)樣溫度為250°C，離子源（EI)溫度為220°C，采用 不分流進(jìn)樣I UL，載氣為高純氦氣。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟葹?00°C，保持2 min，15°C/ min梯度上升至129°C，然后以40°C /min升溫至280°C，保持5min。
[0033] 質(zhì)量控制：采用外標(biāo)法和六點(diǎn)校正標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種PAEs混標(biāo)的基質(zhì) 加標(biāo)平均回收率為92. 5~110. 2%，相對(duì)偏差低于10. 5%，儀器檢測(cè)限為0. 12~0. 45 ug/g。 該方法滿足痕量有機(jī)物定量分析要求。
[0034] 結(jié)果如圖4所示：2D菌在72 h對(duì)高濃度的DBP( 1000 mg/L)降 解效率超過80%，在DBP濃度低于200 mg/L時(shí)，72 h內(nèi)DBP幾乎完全降解，表明該菌對(duì)DBP 具有高效的降解能力。對(duì)DBP中間產(chǎn)物的降解能力分析，可以看出該菌的對(duì)高濃度鄰苯二 甲酸的降解能力顯著低于DBP，但對(duì)低濃度鄰苯二甲酸(< 100 mg/L)降解能力較強(qiáng)(在144 h幾乎完全降解）；鄰苯二甲酸濃度為200 mg/L時(shí)，在144 h的降解率超過90%。說明該菌 對(duì)DBP的主要代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸也有較強(qiáng)的降解能力，最終將DBP完全礦化。
[0035] 實(shí)施例3 2D對(duì)污染土壤中DBP的降解研宄 1、供試土壤制備 土壤為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)水稻土，pH為6. 7, C/N為5. 98,風(fēng)干后過60目篩。動(dòng)物奠 堆肥采自該農(nóng)場(chǎng)，pH為8. 8，C/N為17. 49。按照農(nóng)場(chǎng)常用添加比例(堆肥：土壤=l:15，w/ w)在水稻土中添加堆肥，混勻獲得pH = 7.54, C/N為10.8的改良土。將上述未添加堆肥 土 (常規(guī)土）和改良土分別添加 DBP，使其濃度均達(dá)到100 mg/kg。
[0036] 1、土壤中DBP降解效果分析 實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下處理：接菌的常規(guī)土和改良土作為實(shí)驗(yàn)組；不接菌的常規(guī)土和改良土作 為對(duì)照組一；滅過菌的改良土和先滅菌再接2D菌的改良土作為對(duì)照組二，每組三個(gè)重復(fù)。 分別稱取上述含100 mg/kg DBP的土壤200 g于三角瓶中，向土壤中添加菌懸液（OD6tltl M = 0. 8 ) 50 mL，充分混勻。將土壤調(diào)至田間持水量(約30%的含水量)，在30 °C恒溫箱中避光培 養(yǎng)，定期取樣并經(jīng)GC/MS測(cè)定土壤中DBP殘留量。
[0037] 經(jīng)過10天的ofeflciasp. 2D的生物強(qiáng)化修復(fù)處理，各處理中污染土壤DBP殘 留量動(dòng)態(tài)變化見圖5。接2D菌的常規(guī)土中DBP降解效果顯著增強(qiáng)，在第0、2、4、6、8、10天， 土壤中 DBP 殘留量分別為 98.41 mg/kg、88.13 mg/kg、75.40 mg/kg、61.25 mg/kg、44.85 mg/kg和34. 46 mg/kg，在第10天的降解率達(dá)到了 65%，而未接菌的對(duì)照土壤DBP降解率僅 為19%，說明ofeflciasp. 2D菌能夠顯著增強(qiáng)土壤中DBP的降解。另外，在添加了堆肥 并接菌的改良土中，相對(duì)于未添加堆肥的接菌土，DBP的降解效果進(jìn)一步增強(qiáng)，其第十天的 DBP降解率達(dá)到了 88%，表明堆肥可增強(qiáng)土壤中DBP的降解，將2D菌與堆 肥結(jié)合使用，可高效修復(fù)DBP污染的土壤。
[0038] 另外，未滅菌且接種2D菌的改良土中DBP的降解效率顯著高于滅過菌且接種2D 菌的改良土，說明2D菌與改良土中的土著微生物形成協(xié)同作用，促進(jìn)了土壤中的DBP的降 解。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 普羅威登斯菌（sp. )2D在DBP污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用，其特征在于， 該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCM 2015057。2. 普羅威登斯菌sp. 2D在制備DBP污染土壤修復(fù)改良劑中的應(yīng)用，其 特征在于，該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCCM2015057。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為將普羅威登斯菌 sp. 2D活化后制得的菌懸液接入DBP污染土壤中。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在DBP污染的土壤中添加動(dòng)物糞堆肥并 混勾后再接入普羅威登斯菌sp. 2D菌懸液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述動(dòng)物糞堆肥與DBP污染土壤的質(zhì)量 比為1 :15。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了普羅威登斯菌（Providencia sp.）2D在鄰苯二甲酸二丁酯污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用，該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號(hào)為CCTCC M 2015057；在DBP污染的土壤中接種普羅威登斯菌Providencia sp.2D；在第10天DBP降解率達(dá)65%，相比對(duì)照提高了46%；另外添加了堆肥并接菌的土壤中，其第十天的DBP降解率達(dá)88%，表明堆肥可增強(qiáng)土壤中DBP的降解，將Providenciasp.2D菌與堆肥結(jié)合使用，可高效修復(fù)DBP污染的土壤，對(duì)降低農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中DBP污染具有廣泛的應(yīng)用前景。CCTCC M 201505720150122
【IPC分類】B09C1/10, C12R1/01, C12N1/20
【公開號(hào)】CN104894000
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066107
【發(fā)明人】莫測(cè)輝, 趙海明, 李彥文, 蔡全英, 李慧, 杜歡, 黃獻(xiàn)培, 魯磊安
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日