LA 酶（0.5 yL);總體積（24 yL)。（2)取第二次 PCR 循環(huán)數(shù)較好擴增產(chǎn)物tester 15 yL加入PCR Master混合物，混勾，分裝到10個離心管， 按t 1-10標記。（3)按步驟1-2將第二次PCR擴增driver分裝。（4)快速離心，立即開 始？0?:94°〇(1〇8) ;68°〇(3〇8);72°〇(1.511^11);1-15個循環(huán)。（5)?0?結(jié)束，將10個管 混合，取5 μ L進行2%瓊脂糖凝膠電泳。（6)加入1/10體積的3M NaAC (pH=5. 2)，渦旋混 勾。（7)加入等體積氯仿：異戊醇（24:1)抽提，禍旋混勾，室溫，HOOOrpm離心10min。（8) 取上清，加2. 5倍體積無水乙醇禍旋混合均勾后室溫下靜置30min，14000rpm，離心10min。 (9)棄上清，加適量80%乙醇洗絳沉淀，14000rp0m，離心5min。（10)棄上清，空氣干燥沉淀， 加20 μ L無 RNA水溶解沉淀。（11)取3 μ L樣品進行2. 0 %瓊脂糖凝膠電泳，-20°C保存。
[0046] 在雜交液中進行第一次雜交，雜交結(jié)束后會形成四種雜交產(chǎn)物：a是均一化了的 差異表達的單鏈Tester cDNA;b是自身退火的Tester cDNA雙鏈；c異源退火的是Tester 和Driver cDNA;d是driver cDNA。將兩份第一次雜交樣品進行混合，再加入新鮮熱變性 driver cDNA在緩沖液中進行第二次雜交，進一步除去共有序列，由第一次雜交時在退火中 形成的均一化了的連接不同接頭的差異表達的單鏈Tester cDNA特殊類型的分子e，第二 次雜交補平接頭末端。加入adapter 1和adapter 2R的部分特異序列進行PCR擴增，第一 次PCR擴增時a和d沒有引物結(jié)合位點故不能進行擴增；b兩端連有相同的接頭，接頭上有 反向重復(fù)序列抑制PCR也不能進行擴增；而c是單接頭，只能進行線性擴增；只有兩端連接 有不同接頭的雙鏈DNA分子e才可進行擴增，擴增產(chǎn)物即為目的片段。第二次PCR擴增使接 頭內(nèi)側(cè)的引物選擇性擴增目的片段，經(jīng)過了兩次雜交和兩次Nested PCR，目的片段即被消 減并富集，得到了長度大約在200 bp-1400 bp的均勻的彌散狀片段，平均大小約在400-700 bp左右。
[0047] 抑制消減雜交文庫的構(gòu)建 I. PCR產(chǎn)物連接T載體：（1)在離心管中加入以下試劑：純化PCR產(chǎn)物（4 μ L);PMD 18-T vector I (I yL);Solution I (5 yL)。（2)16。〇連接211〇
[0048] 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：（1)取5 μ L連接產(chǎn)物于一 I. 5mL離心管中，放置于冰上，向其中 加入50 μ L大腸桿菌感受態(tài)，輕彈混勻，冰浴30min ;⑵將混合物于42 °C水浴熱激90 S后 立即置于冰上，期間不要搖動；（3)向混合物離心管中加入200 yL LB固體培養(yǎng)基，37°C， 220rpm振蕩培養(yǎng)45min，取出后放置于冰上；（4)將菌液分別涂布在含有50 μ L IPTG、25 yL X-Gal、50 yL AMP，37°C倒置過夜培養(yǎng)16h;(5)將平皿置于4°C保存2h，使其充分顯 色；(6)挑取單菌落，接種于5 mL含有5 μ L AMP的LB液體培養(yǎng)基，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng) 過夜；（7)培養(yǎng)基明顯變渾濁后，取0. 5 mL菌液于0. 5 mL無菌的30%甘油中保存菌種，標 記，-80°C保存菌種。
[0049] 鑒定插入的目的片段：（1)按次序加入以下試劑制備Master混合物：無 RNA水 (18.7 μ L)；10XPCR buffer (2.5 yL)；Nested PCR Primer I (0.5 yL)；Nested PCR Primer2R(0.5 yL);dNTPMix(0.5 yL);LA 酶（0.3 yL);總體積（23 yL)。（2)微 離，開始 PCR 擴增：94°C (5min);94°C (30s);68°C (30s);72°C (2min);2-33 個循環(huán)；延 伸，72°C(5min)。（3)PCR結(jié)束后，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定為陽性克隆的菌液按 I : 1加30%甘油，于-80°C中保存菌種。經(jīng)SSH消減并富集得到的cDNA片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α感受態(tài)細胞，篩選藍白班，隨機挑取917個克隆，PCR檢測表明大多數(shù)插入片段長度約 在 100-750bp 之間。
[0050] 測序：隨機挑取917個克隆送至北京華大基因進行測序，序列經(jīng)過去載體、宿主序 列重復(fù)序列后進行拼接，其中高質(zhì)量的EST 411個，占總數(shù)的44. 8%，將所得到的EST片段利 用 NCBI 和 ΡΗΥΤ0Ζ0ΜΕ 的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)比對進行序列相 似性分析。
[0051] 文庫中 ESTs實時熒光定量 RT-PCR(Real-time RT-PCR) 將測序獲得的EST片段序列在ΡΗΥΤ0Ζ0ΜΕ上比對得到基因全長，利用Primer 5軟件在 ⑶S區(qū)上設(shè)計引物，以GenBank上登陸的大豆看家基因 actin4(作為內(nèi)參)分別設(shè)計引物。按 照SYBR(R) Ex Script ? RT-PCR Kit的程序進行熒光定量PCR反應(yīng)。東農(nóng)50種子接種于 MS培養(yǎng)基上，在24°C，長日照（16 h光照/8 h黑暗）條件下培養(yǎng)6d，切取子葉節(jié)，分別在加 6-BA和不添加6-BA的液體MS培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)，按I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、 9 h、10 h、ll h、12 h、24 h、48 h 進行取樣，RNAiso Plus 法提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，-80°C 保存。RT-PCR反應(yīng)混合體系：每個樣品進行3次重復(fù)，cDNA第一鏈（I. 6 μ L);上、下游引 物各（1.6 yL);SYBRqPCRMix(10 yL);去離子水（6.8 yL);總體積（20 yLXPCR 反 應(yīng)條件：95°C預(yù)變性（30s);40個循環(huán)：95°C變性（5s);60°C復(fù)性（20s);72°C延伸（20s)。利 用Opticon Monitor 3. 1軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計算基因的相對表達量。EST測序與同源性 檢索結(jié)果：隨機獲得的917個克隆，其中高質(zhì)量的EST 411個，占總數(shù)的44. 8%。將測序結(jié) 果到GenBank進行BLASTn和BLASTx比對，基因功能涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，葡萄糖、蛋白質(zhì)大分子 生物合成代謝，光、葉形態(tài)發(fā)生；細胞凋亡、細胞自身防御、細胞壁分化；各種激素及細胞分 裂素介導(dǎo)的信號通路。
[0052] 文庫中 ESTs實時熒光定量 RT-PCR(Real-time RT-PCR) 從熒光定量數(shù)據(jù)中可以得到以下結(jié)論：酸性磷酸酶基因在6-BA處理的前4h表達量平 穩(wěn)，4h至6h表達量不斷升高，在6h時達到最高表達量，此后開始降低，12h后逐漸趨于平 穩(wěn)，表明基因在6-BA處理后受到抑制作用，屬于負調(diào)控基因。KS/想基因在受6-BA處理后 l-8h表達量平穩(wěn)，8h時開始升高，12h達到最高值后又逐漸下降，基因可能在細胞分裂素途 徑下游起作用。16S ribosomal基因在受細胞分裂素處理后I-Ilh趨于平穩(wěn)，在12h是表達 量達到最高，可以初步確定該基因可能在細胞分裂素途徑下游。膽色素原脫氨酶基因在處 理后第4h時表達量突然升高并到達峰值，后又趨于平衡，基因可能作用在細胞分裂素途徑 上游。
[0053] β? KS/男基因的克隆及序列分析 I. GmVSPB基因引物設(shè)計：從文庫中挑選基因進彳丁克隆，在Phytozome大?基因組中調(diào) 出基因的序列，根據(jù)其CDS區(qū)序列應(yīng)用Primer 5. 0軟件對其設(shè)計引物并添加酶切 位點，在基因上游引物5'端添加 SacI酶切位點，下游引物5'端添加 SmaI酶切位點。引物 序列設(shè)計如下： 表基因擴增所用引物
【主權(quán)項】
1. 一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消減雜交法獲得 GmVSPB 基因（Seq ID No: 1)。
【專利摘要】一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB）基因，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，其特征在于以大豆東農(nóng)50子葉節(jié)為材料，在細胞分裂素6-BA誘導(dǎo)下，抑制消減雜交出差異基因，以期獲得再生相關(guān)基因并進行基因克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物，觀察轉(zhuǎn)基因植株的變化，通過定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研究細胞分裂素對再生的影響；從子葉節(jié)器官發(fā)生途徑結(jié)合激素對大豆再生途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達影響入手，分析再生基因在再生體系中的作用，尋找到一種大豆植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB）基因（Seq ID No:1）。
【IPC分類】C07K14-415
【公開號】CN104877020
【申請?zhí)枴緾N201510025324
【發(fā)明人】蘇安玉, 武小霞, 孫晶
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年1月19日