一種植物營養(yǎng)貯存蛋白(GmVSPB)基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是我國重要的糧食和油料作物，但面對耕地面積日益縮減，糧食安全問題日 益凸顯的情況，要擺脫我國大豆供給緊張，解決大豆依賴進(jìn)口的嚴(yán)峻局面，必須要加快分子 育種研宄的步伐，爭取在短期內(nèi)大幅度提高我國大豆的單產(chǎn)和總產(chǎn)水平。而生物技術(shù)是分 子育種的主要手段，生物技術(shù)在大豆育種中應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵保障就是高效穩(wěn)定的再生體 系。由于大豆再生受基因型影響，只有少數(shù)大豆品種的再生體系比較穩(wěn)定，因此阻礙了生物 技術(shù)在多數(shù)大豆品種中的應(yīng)用。
[0003] 抑制消減雜交技術(shù)（SSH, Suppression Subtractive Hybridization)是分離 克隆差異表達(dá)基因的一種新方法，由Diatchenko等人于1996年提出的，結(jié)合了抑制PCR (Suppression PCR)技術(shù)和消減雜交法而建立的。抑制消減雜交技術(shù)（SSH)是鑒定、分離細(xì) 胞組織中的選擇性差異表達(dá)基因的一種方法，原理是以抑制性PCR為基礎(chǔ)的cDNA消減雜 交技術(shù)(唐江云，張濤，鄭家奎，2009)，經(jīng)過抑制消減雜交后的cDNA群體不僅富集了差 異表達(dá)基因，而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除，消減后獲得的cDNA 群體即為豐度一致的目的基因群體(王芳，2011)。SSH技術(shù)已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和植 物研宄領(lǐng)域。
[0004] 大豆的組織培養(yǎng)研宄始于20世紀(jì)60年代，但到80年代中、后期建立了組織、細(xì) 胞、原生質(zhì)體水平的植株再生技術(shù)，大豆組織培養(yǎng)工作真正進(jìn)入了發(fā)展階段。大豆組織培養(yǎng) 的外植體除了原生質(zhì)體和單細(xì)胞以外，常用的還有胚、子葉、子葉節(jié)、真葉及下胚軸等，有兩 種誘導(dǎo)途徑：一種是器官發(fā)生途徑，即通過外植體的誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽（或稱叢生芽），之后 芽形成不定根，最后形成完整植株；另一種體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生， 胚萌發(fā)成再生植株。1993年，Christianson等（1993)以幼胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā) 生，首次獲得了再生植株。隨著研宄的發(fā)展，后來采用的外植體多為未成熟胚、下胚軸和現(xiàn) 在被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)化的子葉節(jié)。將這些外植體培養(yǎng)在添加不同種類和濃度的細(xì)胞分裂素的 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽后再生植株，培養(yǎng)基主要是MS或B5基本培養(yǎng)基，常用的植物激 素有6-BA、NAA、IBA和IAA等，集中研宄基因型、培養(yǎng)基類型、激素濃度及外植體種類等對 不定芽形成的影響。至今為止，以成熟胚子葉、子葉節(jié)和幼胚軸等作為外植體的再生體系已 經(jīng)成功獲得再生大豆植株。由于大豆器官發(fā)生的外植體具有來源廣、組織培養(yǎng)時(shí)間短等特 點(diǎn)，因此僅用3個(gè)月即可得到再生大豆植株，這樣得到的再生植株嵌合體居多，篩選難度很 大，使得鑒定、篩選傳代和純化再生大豆植株的工作量大大地加大了。
[0005] 在20世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)了一種專門的貯藏蛋白，廣泛存在于營養(yǎng)器官中，區(qū) 別于種子IC藏蛋白，稱為植物營養(yǎng)IC存蛋白（vegetative storage proteins, VSP)，這種 貯藏蛋白首先是在樹木中發(fā)現(xiàn)的，是作為植物氮源的貯存形式而被人們認(rèn)識(shí)。大豆的VSP 最早是從葉中鑒定出來，也以大豆葉中的營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)研宄得最為深入。大豆是世界上 公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化的作物，大豆的高效遺傳轉(zhuǎn)化也一直是植物基因工程領(lǐng)域的難點(diǎn)之一。國內(nèi) 外相繼報(bào)道了以大豆不同組織為外植體，通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生以及從原生質(zhì)體培養(yǎng)獲 得成功的再生植株，但突破性的進(jìn)展卻很少，即轉(zhuǎn)化率還沒有顯著提高。這種情況大大影響 了大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，所以大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)研宄的重心應(yīng)該轉(zhuǎn)移到大豆高效再生體系 的建立及大豆再生相關(guān)基因發(fā)生機(jī)理和調(diào)控因子方面，通過優(yōu)化再生條件及分析再生基因 的功能進(jìn)而提高大豆的再生能力，為建立高效、穩(wěn)定的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。 再生相關(guān)基因還能夠以一種新型無爭議的生物安全標(biāo)記基因來替代抗生素、除草劑等選擇 標(biāo)記，在導(dǎo)入外源目的基因的同時(shí)提高受體植物的再生能力，對植物轉(zhuǎn)基因育種效率及轉(zhuǎn) 基因新品種的安全性具有重要意義。目前，雖然對植物的再生相關(guān)基因的研宄較少，但在模 式植物擬南芥、水稻等植物中已有一些調(diào)控再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或基因的研宄和報(bào)道，可 為本研宄奠定一定的理論保證。關(guān)于植物再生相關(guān)基因的克隆在國內(nèi)外報(bào)道甚少，而大豆 再生相關(guān)基因的克隆更是未見報(bào)道，因此，如何通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從根本上提高大 豆的再生能力，找到控制大豆再生的基因，解決大豆再生體系建立難、轉(zhuǎn)化難成為急需解決 的一大難題？所以以大豆東農(nóng)50子葉節(jié)為材料，在細(xì)胞分裂素6-BA誘導(dǎo)下，抑制消減雜交 出差異基因，獲得再生相關(guān)基因并進(jìn)行基因克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物，觀察轉(zhuǎn) 基因植株的變化，通過定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研宄細(xì)胞分裂素對再生的影 響；從子葉節(jié)器官發(fā)生途徑結(jié)合激素對大豆再生途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)影響入手， 分析再生基因在再生體系中的作用，尋找再生基因并對基因進(jìn)行克隆和改造；從分子水平 上分析基因的功能并研宄其作用機(jī)理，為發(fā)掘大豆再生基因，提高大豆的再生和遺傳轉(zhuǎn)化 效率，發(fā)明一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)試圖從根本上提高大豆的再生能力，解決大豆再生 體系建立難、轉(zhuǎn)化難的難題，本發(fā)明提供了一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因，該發(fā)明以 大豆東農(nóng)50子葉節(jié)為材料，在細(xì)胞分裂素6-BA誘導(dǎo)下，抑制消減雜交出差異基因，以期獲 得再生相關(guān)基因并進(jìn)行基因克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物，觀察轉(zhuǎn)基因植株的變 化，通過定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研宄細(xì)胞分裂素對再生的影響；從子葉節(jié) 器官發(fā)生途徑結(jié)合激素對大豆再生途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)影響入手，分析再生基因 在再生體系中的作用，尋找到大豆植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因 （Seq ID No: 1)。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 本發(fā)明的一種一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消減雜交法 獲得GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)。具體步驟如下： 本發(fā)明的一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消減雜交法 獲得GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)。具體步驟如下：①抑制消減雜交法：首先，獲得大豆子 葉節(jié)并用6-BA處理；接著，用RNAiso Plus的方法提取大豆子葉節(jié)的總RNA，采用SMART (Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技術(shù)合成cDNA，純化雙鏈cDNA， 純化RsaI酶切及其產(chǎn)物，接頭連接，雜交，分析消減雜交后兩次PCR擴(kuò)增的結(jié)果，純化PCR 產(chǎn)物，構(gòu)建抑制消減雜交文庫，最后，克隆基因 （Seq ID No: 1)并對其序列分析。 ②GmVSPB基因的生物信息學(xué)分析（Seq ID No:2)。③GmVSPB基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建。 ④中間載體的構(gòu)建。⑤GmVSPB植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：利用凍融法將物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn) 入農(nóng)桿菌菌株。轉(zhuǎn)化后挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒。通過PCR擴(kuò)增獲得條帶大小為977bp， 表明成功將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。I.農(nóng)桿菌的制備及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)的制 備；ii.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定。⑥子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化大豆：將目的基因 GmVSPB基因轉(zhuǎn)入植物體 中。II.子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化大豆：i.轉(zhuǎn)化中用到的培養(yǎng)基；ii.大豆種子滅菌劑子葉節(jié)外植體 的獲得：①侵染與共培養(yǎng)；②叢生芽的誘導(dǎo)及篩選；③抗性芽的伸長和生根；④抗性植 株的馴化。⑦轉(zhuǎn)基因植株的檢測轉(zhuǎn)基因大豆DNA的提?。篠DS小量法提取植物總DNA ; Π .轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定；III.過表達(dá)大豆的檢測。⑧GmVSPB基因的組織特異性表達(dá)： 結(jié)果表明命KS/想基因在子葉中表達(dá)量最高，其次是莖、根，可推測該基因在子葉再生，莖的 伸長中發(fā)揮一定的作用。
[0008] 本發(fā)明的有益效果為:一種植物營養(yǎng)貯存蛋白（GmVSPB)基因發(fā)現(xiàn)①利用抑制 消減雜交的方法，以大豆DN50的子葉節(jié)為材料，以細(xì)胞分裂素6-BA作為誘導(dǎo)條件，構(gòu)建了 大豆再生相關(guān)基因的cDNA消減文庫。②克隆獲得GmVSPB基因，并成功構(gòu)建了 GmVSPB基因 的植物表達(dá)載體。GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)的765bp的⑶S區(qū)共編碼254個(gè)氨基酸序列 (Seq ID No:2)，其分子量為29. 28041kDa，理論等電點(diǎn)PI為6. 72。③利用農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，采 用子葉節(jié)法將GmVSPB基因的植物表達(dá)載體進(jìn)行大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。④Real-time RT-PCR分 析表明，GmVSPB在大豆根、真葉、三出復(fù)葉、莖、花芽、中均有表達(dá)，但表達(dá)具有組織特異性， 對大豆子葉再生和莖伸長表現(xiàn)最明顯。⑤Real-time RT-PCR分析表明，GmVSPB的表達(dá)受 6-BA的調(diào)控誘導(dǎo)，在6-BA處理2h后表達(dá)量開始持續(xù)上升，在8h時(shí)達(dá)到峰值，而后又逐漸 下降。
【附圖說明】