一種早期檢測(cè)楊梅是否發(fā)生凋萎病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物疾病診斷領(lǐng)域，特別的屬于一種早期檢測(cè)楊梅是否發(fā)生凋萎病的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 楊梅（Myrica rubra Sieb. Et Zucc.)是我國(guó)南方特有的珍稀水果，果實(shí)甜酸適 口，風(fēng)味獨(dú)特，在國(guó)內(nèi)外享有盛譽(yù)，因其顯著的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)效益，已成為浙江省主要水果種 類，其產(chǎn)值已穩(wěn)居各類水果首位。楊梅凋萎病是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種病害，發(fā)病初期楊梅部 分嫩梢干枯，隨病情加重，嫩梢干枯數(shù)量逐漸增多并蔓延至全樹(shù)，發(fā)病后3-5年整株死亡。 楊梅凋萎病在浙江省楊梅主產(chǎn)區(qū)呈迅速蔓延趨勢(shì)，嚴(yán)重影響楊梅產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展(求盈 盈等2011)。楊梅凋萎病病原菌為異色擬盤多毛孢（Pestalotiopsis versicolor)和小孢 擬盤多毛孢（P. microspora)，病菌主要定殖于楊梅枝干以及枝的韌皮部。
[0003] 一般，在楊梅出現(xiàn)枯枝或者出現(xiàn)大量枯枝的時(shí)候，在楊梅發(fā)病的組織中已經(jīng)存在 大量的病原菌。這個(gè)時(shí)候，如果采取施加藥劑進(jìn)行防治，已經(jīng)起不到很好的效果。這就需要 早期進(jìn)行楊梅凋萎病菌的檢測(cè)，提早進(jìn)行凋萎病的有效進(jìn)行防治，減少損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種早期檢測(cè)楊梅是否發(fā)生凋萎病的方法，該方法包括：對(duì)楊梅的組 織的DNA進(jìn)行定量擴(kuò)增，如果每100ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/ 和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)大于1X10 6,則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)一定會(huì)發(fā)生凋萎病，如果每 lOOng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)小 1X10 5,則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)不會(huì)發(fā)生凋萎病。
[0005] 在一些優(yōu)選的方式中，如果每100ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛 孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)大于1X10 7、1X108或1X10 9,則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)一定 會(huì)發(fā)生凋萎病。
[0006] 在一個(gè)優(yōu)選的方式中，植物組織為楊梅樹(shù)一年生嫩枝中的組織。定量擴(kuò)增的方法 為熒光RT-PCR。
[0007] 在另一個(gè)優(yōu)選的方式中，所述的楊梅的凋萎病由異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤 多毛孢菌所造成的。優(yōu)選的，所述的楊梅的凋萎病由保藏號(hào)為CGMCC No. 8714的異色擬盤 多毛孢菌株P(guān)VXJ1或/和保藏號(hào)碼為CGMCC No. 8713的小孢擬盤多毛孢PMYS1菌株所引起 的。
[0008] 在優(yōu)選的方式中，檢測(cè)所用的引物為GAAATGACGCTCGAACAGGC和 TGAAGAACGCAGCGAAATGC ;或引物對(duì)為 GAACAGGCATGCCCACTAGA 和 ATCGATGAAGAACGCAGCGA。
[0009] 在一些優(yōu)選的方式中，一旦發(fā)現(xiàn)每100ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤 多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)大于1X10 6,立即對(duì)楊梅樹(shù)進(jìn)行藥物防治。如果每 lOOng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)小 1X105,不需要對(duì)楊梅樹(shù)進(jìn)行藥物防治，進(jìn)行正常的田間管理。
[0010] 對(duì)于保藏真菌的生物學(xué)特性說(shuō)明
[0011] 菌株P(guān)VXJ1保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)碼為 CGMCC No. 8714,地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，拉丁 學(xué)名：Pestalotiopsis versicolor，中文名稱為：異色擬盤多毛孢，保藏日期為：2014年01 月10日。
[0012] 第二個(gè)菌株P(guān)MYS1保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 號(hào)碼為CGMCC No. 8713,地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄 所，拉丁學(xué)名：Pestalotiopsis microspora，中文名稱為：小孢擬盤多毛孢，保藏日期為： 2014年01月10日。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)用的拷貝數(shù)與CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0014] 圖2標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖；
[0015] 圖3標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線圖。
[0016] 有益效果
[0017] 使用本發(fā)明的方法，可以早起鑒定楊梅樹(shù)是否具有發(fā)生凋萎病的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)DNA 的拷貝數(shù)的多少預(yù)測(cè)楊梅樹(shù)凋萎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，可以提前預(yù)測(cè)凋萎病的發(fā)生，采取及時(shí)有 效的防治措施。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 1材料和方法
[0019] 1. 1樣品采集及預(yù)處理
[0020] 1. 2 試劑
[0021] 真菌分離純化所用的PDA培養(yǎng)基購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增所用 的Taq DNA聚合酶、dNTPs (4種混合)、10XPCR buffer均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任 公司，擬盤多毛孢的特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所 用的SYBR熒光試劑、pMD18-T載體及感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。CTAB 法提取基因組所需的試劑均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，具體試劑見(jiàn)下表。
[0022] 表1實(shí)驗(yàn)試劑名稱及生產(chǎn)商
[0023]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種早期檢測(cè)楊梅是否發(fā)生凋萎病的方法，其特征在于，該方法包括：對(duì)楊梅組織 的DNA進(jìn)行定量擴(kuò)增，如果每100 ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/ 和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)大于1X106,則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)一定會(huì)發(fā)生凋萎病，如果每 100ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)小 1X105,則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)不會(huì)發(fā)生凋萎病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，如果每100ng的植物組織DNA中可以檢 測(cè)的異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)大于lXIO'lXlO8或1X10 9,則表示該 楊梅樹(shù)在將來(lái)一定會(huì)發(fā)生凋萎病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，植物組織為楊梅樹(shù)一年生嫩枝中的組織。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，定量擴(kuò)增的方法為熒光RT-PCR。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的楊梅的凋萎病由異色擬盤多毛孢 或/和小孢擬盤多毛孢菌所造成的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的楊梅的凋萎病由保藏號(hào)為CGMCC No.8714的異色擬盤多毛孢菌株P(guān)VXJl或/和保藏號(hào)碼為CGMCCNo.8713的小孢擬盤多毛 孢PMYSl菌株所引起的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，檢測(cè)所用的引物為 GAAATGACGCTCGAACAGGC 和 TGAAGAACGCAGCGAAATGC ;或引物對(duì)為 GAACAGGCATGCCCACTAGA 和 ATCGATGAAGAACGCAGCGA 〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種早期檢測(cè)楊梅是否發(fā)生凋萎病的方法，其特征在于，該方法包括：對(duì)楊梅組織的DNA進(jìn)行定量擴(kuò)增，如果每100ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)大于1X106，則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)一定會(huì)發(fā)生凋萎病，如果每100ng的植物組織DNA中可以檢測(cè)的異色擬盤多毛孢或/和小孢擬盤多毛孢的拷貝數(shù)小1X105，則表示該楊梅樹(shù)在將來(lái)不會(huì)發(fā)生凋萎病。使用本發(fā)明的方法，可以早起鑒定楊梅樹(shù)是否具有發(fā)生凋萎病的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)DNA的拷貝數(shù)的多少預(yù)測(cè)楊梅樹(shù)凋萎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，可以提前預(yù)測(cè)凋萎病的發(fā)生，采取及時(shí)有效的防治措施。871320140110 871420140110
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-645
【公開(kāi)號(hào)】CN104846064
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410085999
【發(fā)明人】任海英, 戚行江, 梁森苗, 鄭錫良, 張振蘭, 朱瀟婷
【申請(qǐng)人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2014年3月10日