一種稻米糊化溫度調(diào)控基因的分子標(biāo)記和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種稻米糊化溫度調(diào)控基因的分子標(biāo)記和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國重要的農(nóng)作物，稻米品質(zhì)直接關(guān)系到水稻生產(chǎn)的經(jīng)濟效益和人民的生活質(zhì)量。糊化溫度是稻米中的淀粉粒在熱水中吸水失去結(jié)晶性而不可逆轉(zhuǎn)地膨脹，形成淀粉糊時的溫度，它與稻米中的淀粉的物理特性密切相關(guān)，是稻米蒸煮品質(zhì)至關(guān)重要的衡量指標(biāo)。傳統(tǒng)的對稻米糊化溫度性狀的選擇方法，往往是通過生化手段測定間接地對稻米品質(zhì)進行選擇，這種方法存在周期長、效率低、準(zhǔn)確性較差等缺點。
[0003]可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase，SSS)是控制水稻支鏈淀粉生物合成的關(guān)鍵酶之一。編碼可溶性淀粉合酶II的SSJJa基因，是控制稻米糊化溫度的主效基因。發(fā)明人通過研宄分析不同類型水稻品種SSJJa基因序列多樣性，發(fā)現(xiàn)第8外顯子中SNP變異(GC/TT)與糊化溫度的變異顯著相關(guān)，能將高或中等糊化溫度的水稻品種與低糊化溫度的水稻品種區(qū)分開。
[0004]目前對于SNP的檢測技術(shù)主要有限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、裂解擴增多態(tài)性序列分析(cleaved amplified polymorphic sequence analysis，CAPS)、寡核苷酸連接分析(OLA)等方法。但由于這些標(biāo)記穩(wěn)定性、檢測效率具有較大的局限性，例如CAPS需進行PCR擴增、酶切、電泳分離酶切片段，造成檢測費時且成本較高，難以滿足大規(guī)模分子育種需求。
[0005]四引物擴增受阻突變體系PCR (ARMS-PCR)能夠針對SNP位點進行特異等位擴增。針對已知的變異位點，于兩側(cè)分別設(shè)計I對外引物和I對特異性內(nèi)引物，特異性內(nèi)引物3’末端堿基必須落在突變點的位置上，從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。在同一次擴增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴增片段長度不同，通過產(chǎn)物片段分離中特定條帶的有無可判別個體的基因型，是一種共顯性分型技術(shù)，具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優(yōu)勢。
[0006]分子標(biāo)記的快速、準(zhǔn)確、高效檢測方法是提高育種效率的有力工具，全自動毛細(xì)管電泳具備高分辨率、高敏感性、高通量和自動化的優(yōu)勢，結(jié)合SNP位點的特異等位擴增，能夠?qū)崿F(xiàn)批量化、自動化、快速的基因型檢測，在作物種質(zhì)資源基因分型和群體分子標(biāo)記輔助育種上具有巨大應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有鑒別水稻的稻米糊化溫度的技術(shù)所存在的上述缺陷，提供一種鑒定稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa基因型的分子標(biāo)記。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子標(biāo)記在鑒定稻米糊化溫度調(diào)控基因SSIIa基因型和/或稻米糊化溫度中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第三個目的是提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的第四個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米糊化溫度調(diào)控基因SSIIa基因型的方法。
[0011]本發(fā)明的第五個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米糊化溫度或同時鑒定稻米糊化溫度和稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa基因型的方法。
[0012]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的:
一種稻米糊化溫度調(diào)控基因的分子標(biāo)記SSIIa-GC/TT，所述分子標(biāo)記SSIIa_GC/TT由一對外引物SSIIa-0-F、SSIIa-O-R和一對內(nèi)引物SSIIa-F-GC、SSIIa-R-TT組成，引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0013]發(fā)明人通過對稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa在不同水稻品種中的等位基因序列比較，在低糊化溫度水稻品種和高糊化溫度水稻品種的SSJJa基因編碼區(qū)第8外顯子找到堿基序列上兩個連續(xù)的SNP組成的GC/TT變異，設(shè)計涵蓋差異位點的功能標(biāo)記SSIIa-GC/TT0
[0014]本發(fā)明所述SSIIa-F-GC和SSIIa-R-TT的3’端第3個堿基引入錯配堿基。
[0015]提供上述分子標(biāo)記在鑒定稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa基因型和/或稻米糊化溫度中的應(yīng)用。
[0016]提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0017]提供利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa基因型的方法；具體地，該方法包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提取；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標(biāo)記進行PCR擴增；
S3利用凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析PCR擴增后的產(chǎn)物，進行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)192bp和293bp條帶，則表明待測樣品的糊化溫度調(diào)控基因SSJTa為高糊化溫度基因型；若出現(xiàn)144bp和293bp條帶，則表明待測樣品的糊化溫度調(diào)控基因SSJTa為低糊化溫度基因型；若出現(xiàn)144bp、192bp和293bp條帶，則表明待測樣品的糊化溫度調(diào)控基因SSJJa為雜合型。
[0018]提供利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米糊化溫度或同時鑒定稻米糊化溫度和稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa基因型的方法，具體地，該方法包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提取；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標(biāo)記進行PCR擴增；
S3利用凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析PCR擴增后的產(chǎn)物，進行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)192bp和293bp條帶，則表明待測樣品的糊化溫度調(diào)控基因SSJTa為高糊化溫度基因型，待測樣品為高糊化溫度品種；若出現(xiàn)144bp和293bp條帶，則表明待測樣品的糊化溫度調(diào)控基因SSJJa為低糊化溫度基因型，待測樣品為低糊化溫度品種；若出現(xiàn)144bp、192bp和293bp條帶，則表明待測樣品的糊化溫度調(diào)控基因SSJTa為雜合型，待測樣品為中間糊化溫度品種。
[0019]優(yōu)選地，上述方法中，所述PCR反應(yīng)體系為:DNA模板1.0 uL, SSIIa-Q-F 0.3uL、SSIIa-O-R 0.3uL、SSIIa-F-GC 0.3uL、SSIIa-R-TT 0.3uL、2XPower Taq PCR Master Mix
7.5uL，用雙蒸滅菌水補足至15uL。
[0020]優(yōu)選地，上述方法中，所述PCR擴增的條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C 30s，57°C30s，72°C 35s共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸1min。
[0021]進一步地，發(fā)明人通過實驗研宄發(fā)現(xiàn)，必須同時使用SSIIa-GC/TT標(biāo)記中的4條引物才能得到準(zhǔn)確檢測水稻稻米糊化溫度和/或稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa的基因型。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明基于ARMS-PCR原理，設(shè)計了一種鑒定稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa基因型的分子標(biāo)記，該標(biāo)記擴增片段適中、特異性強；利用該標(biāo)記僅僅通過簡單的PCR，可對稻米糊化溫度調(diào)控基因SSJJa進行基因分型，區(qū)分高或中等糊化溫度的水稻品種與低糊化溫度的水稻品種，利用該標(biāo)記可提高檢測SSJJa基因型的效率，實現(xiàn)對水稻稻米糊化溫度的分子標(biāo)記輔助選擇，本發(fā)明所述分子標(biāo)記可以用于水稻改良分離群體的分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說明】
[0023]圖1為SSIIa-GC/TT引物設(shè)計示意圖；其中等位變異位點分別以紅色背景標(biāo)識，引物錯配堿基以下劃線標(biāo)識。
[0024]圖2為SSIIa-GC/TT擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分型；其中，1:珍汕97B ；2:粵豐新占；3:珍汕97B/粵豐新占；4:明恢63 ；5:9311 ；6:Y華農(nóng)B。
[0025]圖3為SSIIa-GC/TT聯(lián)合全自動毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果；其中M為DNA ladder ;1?
47為檢測水稻材料，1_3、6、8、10、12 ?13、15、17_19、21、27、29、32 ?34、36、38、41 ?42:CG/CG 型;4，7、9、14、16、20、22-26、28、30 ?31、35、37、39 ?40,43 ?47:TT/TT 型;5、11:CG/TT 型。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027]實施例1水稻SSJTa基因功能性標(biāo)記SSIIa-GC/TT的引物設(shè)計及擴增片段分析
1、引物設(shè)計
通過對水稻糊化溫度調(diào)控基因SSJJa在不同水稻品種中的等位基因序列比較，低糊化溫度水稻品種和高糊化溫度水稻品種的SSJJa基因編碼區(qū)第8外顯子找到堿基序列上兩個連續(xù)的SNP組成的GC/TT變異，設(shè)計涵蓋差異位點的功能標(biāo)記SSIIa-GC/TT，同時在等位特異引物的3’端第3個堿基引入錯配堿基，增加特異性(圖1)。所述的SSIIa-GC/TT由4個引物 SSIIa-0-F、SSIIa-O-R, SSIIa-F-GC 和 SSIIa-R-TT 構(gòu)成，引物序列(5’ -3’ )如下:
SSIIa-O-F:CGTTCGACCCGTTCGAGGACACSSIIa-O-R:GCCAAGCTTCTTCAGGGAGGCTASSIIa-F-GC:AAGTACAAGGAGAGCTGGAGGGTGCSSIIa-R-TT:ACATGCCGCGCACCTGGGAA
(引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯配堿基，加框的堿基為要檢測的變異堿基)
2、擴增片段分析
高糊化溫度(CG/CG純合型)、低糊化溫度(TT/TT純合型)和雜合型(CG/TT雜合型)，都能利用SSIIa-O-F和SSIIa-O-R擴增出大小約為293 bp的條帶，此帶可以用于PCR擴增與否的監(jiān)測。此外，高糊化溫度(CG/CG純合型)還能利用SSIIa-F-GC和SSIIa-O-R擴增出一條192 bp的條帶；低糊化溫度(TT/TT純化型)能利用SSIIa-O-F和SSIIa-R-TT擴增出一條144 bp的條帶；雜合型(CG/TT雜合型)既能擴增出192 bp的條帶又能擴增出144 bp的條帶。
[0028]實施例2利用分子標(biāo)記SSIIa-GC/TT檢測6個水稻品種糊化溫度調(diào)控基因的基因型
1、水稻基因組DNA的提取
以6個水稻品種為材料:珍汕97B、明恢63、Y華農(nóng)B、9311、粵豐新占和珍汕