一種利用水生拉恩氏菌制備生物納米硒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于微生物應(yīng)用與納米砸合成領(lǐng)域，具體地，涉及利用水生拉恩氏菌制備生物納米砸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]砸(Se)是動物和人類所必需的一種微量元素，與人體內(nèi)抗氧化功能，甲狀腺激素代謝，和免疫系統(tǒng)等密不可分。缺砸會造成人類肌肉萎縮，心血管、骨骼或免疫系統(tǒng)疾病，增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，但過量砸也會對人體產(chǎn)生毒害。然而，在我國砸的分布極不均勻，缺砸地區(qū)占有相當(dāng)大的比例，迫切需要解決。目前，通過補(bǔ)食植物富砸產(chǎn)品的應(yīng)用最為廣泛，其生產(chǎn)主要是依靠施用砸肥補(bǔ)充砸鹽，但砸鹽具有較高的毒性，會對環(huán)境帶來潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]據(jù)研宄納米材料可表現(xiàn)出新的特征，比如表面活性高，比表面積大，活性位點(diǎn)多，及較高的催化效率等，應(yīng)用范圍廣泛。而納米砸作為一種有益的低毒元素逐漸成為研宄熱點(diǎn)，用納米砸作為抗氧化劑可以降低砸毒害風(fēng)險(xiǎn)，納米砸顆粒與C = O，COO和C-N組蛋白結(jié)合時(shí)會表現(xiàn)出重要的生物活性，可用于生物、化學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域，比如可以生產(chǎn)砸-維生素、食品添加劑、新型抗生素衣料，納米砸醫(yī)用材料以及在防治癌癥方面的應(yīng)用等。納米砸還能夠抑制人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的生長以及致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長。并且納米砸具有很好地光電學(xué)和半導(dǎo)體特性，已廣泛應(yīng)用于太陽能電池、整流器、傳感器，靜電復(fù)印等光電元件。所以納米砸在工業(yè)、保健品產(chǎn)業(yè)及富砸農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)中具有極大地應(yīng)用潛力。
[0004]納米砸通常通過化學(xué)反應(yīng)，結(jié)晶技術(shù)，反向膠束法等技術(shù)生成，但這些技術(shù)會受到高溫、高壓、催化劑等條件限制，而且會對環(huán)境造成危害，生產(chǎn)的納米砸性質(zhì)也不穩(wěn)定。進(jìn)而需要一種清潔，無毒，環(huán)保的方法來生產(chǎn)穩(wěn)定的納米砸。
[0005]細(xì)菌對砸在自然界中的循環(huán)發(fā)揮著重要作用，尤其是根際促生菌(PGPR)可促進(jìn)植物對砸的吸收。已發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌如如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum Molisch)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)等可將氧化態(tài)砸還原為無毒高效的紅色納米砸，而且這種納米砸性質(zhì)穩(wěn)定，活性高。由于細(xì)菌具有生長迅速、繁殖快、代謝能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以利用微生物轉(zhuǎn)化砸不受季節(jié)和氣候的影響，生產(chǎn)周期短，故利用細(xì)菌合成生物納米砸被認(rèn)為是一種高效砸的生物轉(zhuǎn)化和降低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的解決方式之一。其中水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2具有很好的溶解磷作用，產(chǎn)生植物促生物質(zhì)IAA和PQQ，同時(shí)能夠產(chǎn)生植物抗菌物質(zhì)，對植物具有防病促生效果，目前還未見利用水生拉恩氏菌合成生物納米砸的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種生物納米砸的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供水生拉恩氏菌在制備生物納米砸中的用途。
[0008]本發(fā)明的生物納米砸的制備方法，是以砸酸鹽或亞砸酸鹽為原料，以水生拉恩氏菌為發(fā)酵菌，發(fā)酵生產(chǎn)生物納米砸。
[0009]本發(fā)明的生物納米砸的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)活化的水生拉恩氏菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，加入砸酸鹽溶液；
[0011](2)振蕩培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明的生物納米砸的制備方法，還包括步驟(3)收集培養(yǎng)液，離心，沖洗沉淀，向沉淀中加入氫氧化鈉溶液，沸水浴，靜置至室溫，再加入正己烷溶液，靜置分層后取下層的紅色溶劑相。
[0013]其中步驟(3)中，離心條件為8000_12000r/min，離心5_15min ;向沉淀中加入IN氫氧化鈉溶液，沸水浴15-25min，再加入總?cè)芤?/2體積的正己烷，攪拌均勻，靜置分層后取下層的紅色溶劑相。
[0014]優(yōu)選地，離心條件為10000r/min，離心1min ;沸水浴20min。
[0015]本發(fā)明的上述方法，還包括步驟(4)用鹽酸調(diào)紅色溶劑相pH值7.5-7.0，離心去上清，重復(fù)操作多次后，將沉淀懸浮于去離子水中，得到生物納米砸懸浮液。
[0016]優(yōu)選地，步驟(4)用鹽酸調(diào)紅色溶劑相pH值7.2。
[0017]進(jìn)一步地，步驟(4)中，鹽酸濃度為6M，離心條件為8000-12000r/min，30min。
[0018]進(jìn)一步地，本發(fā)明的生物納米砸制備方法中，步驟(I)的砸酸鹽為砸酸鈉或亞砸酸鹽為亞砸酸鈉；當(dāng)為砸酸鈉時(shí)，其在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為50-575mM ;當(dāng)為亞砸酸鈉時(shí)，其在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為5-75mM。
[0019]更進(jìn)一步地，當(dāng)為砸酸鈉時(shí)，其在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為80mM ;當(dāng)為亞砸酸鈉時(shí)，其在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為15mM。
[0020]優(yōu)選地，本發(fā)明方法中所用的水生拉恩氏菌為保藏編號為CGMCC N0.1896的水生拉恩氏菌HX2。該菌已于2006年12月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，簡稱CGMCC，郵編100101)保藏，分類命名為水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis。
[0021 ] 本發(fā)明的方法中，步驟⑵振蕩培養(yǎng)的條件為26-28 0C，160-200r/min,培養(yǎng)72-96ho
[0022]優(yōu)選地，步驟(2)振蕩培養(yǎng)的條件為28°C，180r/min，培養(yǎng)72_96h。
[0023]本發(fā)明還提供了水生拉恩氏菌在制備生物納米砸中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明制備生物納米砸的方法清潔無毒，環(huán)保高效，合成的納米砸性質(zhì)穩(wěn)定，雜質(zhì)少，粒徑均一，分散度好，可用于生產(chǎn)富砸產(chǎn)品。本發(fā)明方法彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法生產(chǎn)納米砸及富砸產(chǎn)品方式的不足，從而達(dá)到環(huán)保高效的效果，可廣泛應(yīng)用于富砸產(chǎn)品的開發(fā)等領(lǐng)域，同時(shí)該生物納米砸在工業(yè)、保健品產(chǎn)業(yè)應(yīng)用潛力巨大，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【附圖說明】
[0025]圖1為不同濃度亞砸酸鈉對水生拉恩氏菌HX2菌的影響圖。
[0026]圖2為不同濃度砸酸鈉對水生拉恩氏菌HX2菌的影響；
[0027]圖3為添加15mM亞砸酸鈉所得納米砸與水生拉恩氏菌混合液檢測圖，其中圖3A為環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)照片，圖3B為透射電子顯微鏡(TEM)照片，圖3C為納米砸能譜(EDX)分析圖，箭頭所指為納米砸顆粒分析；
[0028]圖4為添加200mM砸酸鈉所得納米砸與水生拉恩氏菌混合液檢測圖，其中圖4A為環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)照片，圖4B為透射電子顯微鏡(TEM)照片，圖4C為納米砸能譜(EDX)分析圖，箭頭所指為納米砸顆粒分析；
[0029]圖5為分離純化所得生物納米砸顆粒透射電子顯微鏡(TEM)照片；
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0031 ] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0032]實(shí)施例1水生拉恩氏菌對亞砸酸鈉(Na2SeO3)的耐受實(shí)驗(yàn)
[0033]1、1^液體培養(yǎng)基為:似(:1 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去離子水1L，121°C高壓滅菌20min。
[0034]LB固體培養(yǎng)基:NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，去離子水1L，分裝至10mL的三角瓶中(25mL/瓶)，121°C高壓滅菌20min。
[0035]分別向上述高壓滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中加入提前過濾除菌的IM的亞砸酸鈉母液配制成以下濃度 OmM(CK)、60mM、70mM、75mM、85mM、95mM、105mM、115mM 的含亞砸酸鈉的 LB
培養(yǎng)基。
[0036]2、吸取100 μ L活化好的水生拉恩氏菌ΗΧ2菌液(OD6tltl= 0.8)，用0.85 %的生理鹽水梯度稀釋，最終得到稀釋度分別為10_3、10_4、10_5、10_6的菌液待用。
[0037]3、分別吸取2.5 μ L上述梯度(10_3、10_4、10_5、10_6)的菌液滴加到含不同砸濃度的平板上，每個(gè)梯度重復(fù)三次，待菌滴晾干后，將平板倒置于，28°C條件下靜置培養(yǎng)96h。
[0038]4、結(jié)果如圖1所示:培養(yǎng)96h后將平板取出觀察①顏色:60?115mM的7個(gè)處理中，稀釋度為10_3、10_4、10_5均有紅色菌落長出，當(dāng)處理濃度高于75mM時(shí)，隨著處理濃度的增加，紅色顯著變淡單個(gè)菌落大小:當(dāng)處理濃度高于75mM之后，各處理?xiàng)l件下單個(gè)菌落的尺寸相對于空白對照CK(不添加亞砸酸鈉的LB平板)明顯變??；③菌落個(gè)數(shù):當(dāng)稀釋度為10_5時(shí)，砸濃度為75mM的處理下的單菌落個(gè)數(shù)與空白對照CK的菌落個(gè)數(shù)之間具有顯著性差異(P〈0.05)。
[0039]5、最小抑制濃度的確定:綜合上述步驟4中的分析，得到亞砸酸