方式移動通過兩個孔；和（d)當多核巧酸的各核巧酸 通過孔之一時，通過測量穿過該孔的離子電流來識別通過該孔的核巧酸。 實施例
[0095] 通過參考下面的實施例進一步限定本發(fā)明。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不偏離 當前發(fā)明范圍的情況下，實現(xiàn)對路線和方法的眾多修改是顯而易見的。
[0096] 實施例1孔內(nèi)單個dsDNA分子的捕獲和控制
[0097] 本實施例說明將進入兩孔裝置的各孔的DNA捕獲（事件）不難檢測為所測得各獨 立離子孔電流的變化（情況）。
[0098] 本實施例示出雙孔捕獲，使用具有或沒有附著到一末端的珠的dsDNA。還探討使用 珠系ssDNA的實驗。
[009引 DNA捕獲和停留后，最接近珠的孔電壓（VI，圖1(1)，在從室A捕獲時）可從逆轉(zhuǎn)， 并增大直到DM上的競爭力將它拉回到室A。在任一孔的離子電流不難在實驗過程中檢測DNA的捕獲和離去。
[0100] 當使用珠時，珠具有合適的大小防止珠通過任一孔或兩孔。本領(lǐng)域已經(jīng)研發(fā)出確 保珠DNA之比為1比1的方法。例如，偶聯(lián)于生物素化的DNA雙鏈體（或ssDNA)的單價鏈 霉親和素涂布量子點（孤S;孤655,（英杰公司Hnvitrogen)可W提供直徑范圍在20-30納 米的珠，使用金粒子或乳膠可能得到較大的珠（30-100納米）。在設(shè)計實驗時可W考慮珠對 流體力學和電荷的影響，因它與捕獲速率有關(guān)。
[010。無珠情況下，dsDNAW~0.ImsAbp通過孔?？蒞使用長度為500bp和地bp的DNA 和入瞻菌體dsDNA分子（~4祉bp)。DNA樣本可W從室A傳遞到兩孔，對各孔使用公共電 壓極性W促進從室A進行捕捉及通過室B進入室C(圖1 (I))。大持續(xù)長度（persistence length)的dsDNA( -庫恩長度為100納米）確保各孔內(nèi)DM區(qū)段可能完全延伸且是椿狀 的。可W改變電壓和離子濃度W確定足夠的捕獲速率。還可W在各室內(nèi)使用不同的緩沖離 子濃度W提高或改變捕獲速率，W及記錄各孔內(nèi)DNA出現(xiàn)的電導變化值。
[0102] 使用10納米和更大的納米孔直徑可最大限度減少dsDNA和納米孔壁之間的相互 作用（例如，摩擦和附著）。對于較大的孔，雖然dsDNA可WW未折疊或折疊結(jié)構(gòu)捕獲，但在 較高電壓使用較短的dsDNA(《3化P)，更可能是單列（未折疊）結(jié)構(gòu)。對于500納米或更 小的孔內(nèi)距離，可W預(yù)計在1MKC1內(nèi)，就電壓至少為200mV而言，在第一孔捕獲后（在室A 和B之間），雙孔捕獲的可能性非常高。
[0103] 對于6-15納米的孔直徑、120-500mv的電壓且dsDNA至少為地bp長，其中電壓 影響主導熱擴散且導致高捕獲可能性的徑向距離估計為至少900納米（大于孔間距） (Gershow和Golovchenko,化1:腳6Nanotechnology, 2:775-779, 2007)。該些發(fā)現(xiàn)支持了在 dsDNA單（第一）孔捕獲后，dsDNA迅速雙孔捕獲的可能性很高。
[0104] 通過兩孔的DNA捕獲和控制可W得益于主動控制硬件和實時算法。發(fā)明人 已經(jīng)開發(fā)了用于DNA控制的主動控制硬件/軟件。參見，例如，Gyarfas等，Biophys. J.，100:1509-16, 2011;Wilson等，ACSNano. ,3(4) :995-1003, 2009 和Benner等，化t. Nanotech.，2007, 2 (11) : 718-24, 2007。有用的軟件為UbVIEW軟件（版本8,美國國家儀器 公司，奧斯汀，德克薩斯州），在FPGA(現(xiàn)場可編程口陣列）系統(tǒng)（PCI-7831R，美國國家儀器 公司）上實施。引用的FPGA可W同時控制最多4臺放大器。此外，用于在PC上數(shù)字化和 記錄數(shù)據(jù)的AxonDigidata1440A數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)具有16輸入通道，足W為最多8個放大器 平行記錄電壓和電流。與用于實時控制和測試的硬件/軟件相配合的其他的實時操作系統(tǒng) 也可W用于控制放大器，數(shù)字化和記錄數(shù)據(jù)。
[0105] 發(fā)明人還開發(fā)了一種低噪聲電壓錯放大器，名為"納米錯"（Nanoclamp) 化im等，IE邸Trans.OnBiom.Circ.AndSyst.待刊，2012 年 5 月；Kim等，Elec. Lette., 47 (15): 844-6, 2011 年7 月；和Kim等，ProceedingsoftheIE邸International SoCDesi即Conference(ISOCC), 2010年11月）W功能化和優(yōu)化一個或多個納米孔在小型 和多通道設(shè)備中的應(yīng)用。任何其他商用臺式電壓錯或膜片錯放大器，或集成的電壓錯或膜 片錯放大器可用于兩孔控制和測量。
[0106] 對于各種固態(tài)孔材料和直徑，0. 1-10化P需要~1毫秒W易位。采用FPGA控制的 放大器，可W在0. 020毫秒內(nèi)檢測捕獲和啟動競爭電壓控制，遠快于化bpDNA的1毫秒總 通過時間，因此，也很有可能在DM(無珠附著）逃脫前啟動控制方法。作為控制示范，分子 從孔離去時間和方向可W示為競爭電壓的量值和其間差異的函數(shù)關(guān)系（圖1(111))。單孔 實驗中，通過實驗觀察到通過孔的長dsDNA(〉化bp)的速度有較大波動，該些波動太大從而 不能歸因于擴散布朗運動。在Lu等，Bio地ysicalJournal，101(l) ;70-79,2011中，將凈 速度波動（即DNA長度除W總通過時間）的主要來源建模為由于電壓誘導粘性阻力影響影 響還沒在孔內(nèi)的DNA部分（除了孔內(nèi)的部分外），其中吸引的電壓區(qū)域延伸。該模型相當 不錯地匹配實驗數(shù)據(jù)。值得注意的是，如果捕獲后，dsDNA物質(zhì)中屯、與孔共線，凈速度更快， 但如果它偏離孔，凈速度較慢。當兩孔裝置內(nèi)的競爭電壓接合時，dsDNA速度不受該粘性阻 力誘導的擾動影響，除非電壓差足夠高。原因是通過兩孔的dsDNA捕獲和競爭電壓接合后， 兩孔之間的dsDNA將完全延伸并為椿狀，因此不能接合W便在臨近任一內(nèi)部孔入口創(chuàng)建結(jié) 構(gòu)。另一方面，各局部孔電壓常迫使孔外側(cè)上的dsDNA結(jié)構(gòu)離開中間室，因此不太可能打亂 孔進入動力學特征。該種結(jié)構(gòu)可能會影響到可控的傳遞動力學性質(zhì)，可利用校準實驗來量 化它。
[0107] 由隨機橫向DNA運動引起的作用力不確定性可能是最小的。此外，電壓力在DNA 運動相反的方向上導致電滲流巧OF)，從而導致與沒有誘導的反粒子流動存在時相比，DNA 的移動慢。由于不同的分子徑向位置可W在納米孔內(nèi)產(chǎn)生不同的EOF場，一個問題是，波動 期間有效的電荷密度和因此的凈驅(qū)動力在DNA徑向位置的改變是否充分W引起速度波動。 據(jù)認為，對于孔壁與DNA之間1納米或更長的距離，1M氯化鐘中有效的DNA電荷密度是穩(wěn)定 的。
[0108] 此外，SiN納米孔具有本質(zhì)上排斥DNA的表面負電荷。因此，雖然通過使用直徑大 于幾納米的SiN孔，分子將經(jīng)歷徑向位置波動，但當在兩孔機構(gòu)內(nèi)使用兩競爭電壓時各恒 定電壓值將在兩孔中每一個上導致恒定的有效作用力從而在較大作用力的方向?qū)е潞愣?的速率是可能的。其他孔材料表面的處理可W產(chǎn)生與SiN相當?shù)男Ч?br>[0109] 可通過增大競爭電壓降低布朗運動導致的隨機平移DNA運動所誘導的速度不確 定性。可W實施實驗W確定是否將發(fā)生該樣的降低。單納米孔研究（Lu等，Bio地ysical 化urnal，101(1) :7〇-79, 2011)支持提高競爭力可W降低由布朗運動導致的不確定性。該研 究分析了由布朗運動引起的在快速時間尺度（納秒級）上發(fā)生的速度波動W及該樣的波動 導致的測序錯誤。假定假設(shè)的和理想化的單核巧酸傳感器（在〉22MH帶寬無噪聲檢測）， 布朗運動單獨導致75%的讀取錯誤。用于預(yù)測誤差的相關(guān)參數(shù)為keT/r化34納米），是熱 能與使得DNA易位核巧酸間距a化34納米）所作功之比。在該比例中，力F=VA，是驅(qū) 動DNA的電壓乘電荷密度A(對于dsDNA，0. 2e7bp)。對于目前的控制方法，增加電壓50X 導致5%的讀取錯誤，采用較高的電壓進一步增大錯誤。但是，采用單孔，由于平均速率為 F*d/(keT)具有擴散常數(shù)山DNA速度也隨F增加，對測序帶寬寄予更不切實際的要求。
[0110] 為了保持22MHz帶寬，采用單納米孔，作用力增加50X必須匹配溶液粘度增加 50XW維持相同的然而，實際上，對于單核巧酸測序，22MHz帶寬已遠高于已經(jīng)證明或 預(yù)計證明的任何實驗性納米孔平臺。此外，采用單納米孔，增大粘度可W放慢DNA最多 10X(Fologea等，NanoLett. ,5巧）：1734-7,2005)。使用兩孔平臺，各電壓可W保持足夠 高，該可W抑制由布朗運動引起的波動，而決定凈DNA速度的差分電壓可W調(diào)節(jié)W確?？?制速率在實際測序帶寬（標稱1千赫茲）內(nèi)。抑制布朗運動引起速度波動的備選方法是 使用反饋控制。在一方面，用10千赫茲帶寬的第二孔電流反饋驅(qū)動10千赫茲帶寬的第一 孔隙電壓，可W補償布朗運動從而在該些千赫茲閉合回路帶寬控制DNA上的可檢測特征 保持在或鄰近第二孔處。該種能力是對在兩維空間內(nèi)抑制布朗運動的反布朗運動電動力 (ABEL)阱的一維模擬，在赫茲閉合回路帶寬通過附著到分子的珠的光學驅(qū)力起作用（Wang 和Moerner,ACSNano, 5:5792-9, 2011)。
[011。 實施例2結(jié)合到DM的RecA絲的檢測與定位
[0112] 本實施例示出兩孔裝置可W用于對DNA結(jié)合蛋白與dsDNA的結(jié)合情況制圖，和用 于具有或未結(jié)合特定序列的蛋白質(zhì)。
[0113] 如實施例1所示，可W從室A捕獲DNA樣本。RecA蛋白催化ATP依賴的DNA鏈交換 反應(yīng)，該反應(yīng)將斷裂DNA和無損DNA的互補區(qū)域配對。使用水解不佳的ATP類似物ATP丫S， 當首先在生理鹽水中組裝時，結(jié)合到daDNA的RecA絲在高鹽（如1M氯化鐘）條件下是非 常穩(wěn)定的。ATP丫S水解緩慢，作為替代，本實施例還使用ADP-AIF4 (四氣化侶），它完全不 翻轉(zhuǎn)，且導致RecA更緊密結(jié)合到DNA。
[0114] 通過20-30納米的納米孔檢測結(jié)合到A-DNA的RecA絲已有例子化owalczyk等， NanoLett. , 10 (1) : 324-8, 2010;Smeets等，NanoLett. , 9 (9) : 3089-95, 2009 ;和Hall等， NanoLett.，9(12) : 4441-5, 2009)，但是由于易位率和測量SNR之間的偶聯(lián)，使用單納米孔 不能分辨長度小于20bp化或更少的RecA蛋白）的絲。
[0115] 本實施例的初步實驗使用已經(jīng)暴露于各種濃度的RecA的珠結(jié)合和未結(jié)合的 入-DNA，從而產(chǎn)生幾乎未包被、部分包被或全包被的DNA。各孔電流的實時監(jiān)控可W用于測 量可控傳遞的進程，并與絲的位置作圖相關(guān)聯(lián)。各DNA的重復(fù)測量將提高RecA作圖的準確 性。
[0116] 當RecA結(jié)合到DNA，增加的電荷和容量，在高鹽條件的穩(wěn)定性，使其成為使用推薦 的儀器在可控傳遞期間嘗試檢測和位置作圖的理想候選。
[0117] 也可嘗試不使用結(jié)合珠來控制RecA結(jié)合DNA從而使得易位停滯。與實施例1中的 dsDNA實驗一樣，在DNA退出納米孔之前，可采用主動電壓控制來立即啟動競爭電壓控制。 因結(jié)合到DNA的荷電物質(zhì)影響DNA在電場中的移動性，通過改變DNA的剛度和凈電荷，運動 控制調(diào)諧實驗?zāi)軌驒z測結(jié)合到dsDNA的RecA對用于控制dsDNA運動的力平衡的影響。
[011引該個例子可W證明在低RecA濃度下，可W在高SNR和足夠慢的可控速率下檢測最 短可觀察的絲長度，W致可W檢測任何孤立的結(jié)合RecA蛋白，如果存在的話。
[0119] 因此兩孔裝置為基礎(chǔ)研究提供了全新的單分子