雙孔裝置的制造方法
【專利說明】雙孔裝置
[0001] 本申請是申請日為2012年07月18日、專利號為化201280005639. 8、發(fā)明名稱為 "雙孔裝置"的發(fā)明專利的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請根據(jù)3抓SC§ 119(e)要求2011年07月20日提交的序列號為61/572, 843 的美國臨時申請的權(quán)益，并通過引用其內(nèi)容全部納入本申請。
【背景技術(shù)】
[0004] 納米孔（nanopore)是在脂膜中自然形成的作為蛋白質(zhì)通道（生物孔）的、或是通 過在固態(tài)基體中鉆孔或蝕刻工程改造（固態(tài)孔）的納米級通路。當(dāng)該樣的納米孔合并入包 括兩個由納米孔隔開的室的納米裝置時，可利用靈敏的膜片錯放大器施加跨膜電壓，并測 量通過該孔的離子電流。
[0005] 納米孔為廉價的全基因組DNA測序提供很大的希望。在該方面，可W通過電泳捕 獲單個DNA分子并驅(qū)使其通過孔，檢測到的各捕獲事件是離子電流的瞬時變化。然后當(dāng)DNA 通過孔通路時，可W從變化的離子電流記錄內(nèi)的圖譜、或從納米孔內(nèi)或附近的一些其他輔 助傳感器推測出DNA分子序列。
[0006] 原則上，納米孔測序器在測序操作過程中無需擴增樣品、使用酶和用于催化的試 劑，也無需用于檢測測序進程的光學(xué)器件，而其中一些或全部器件是常規(guī)合成測序方法所 必需的。
[0007] 納米孔傳感器是純粹的電學(xué)裝置，而且可W檢測其濃度/體積不大于從血液或唾 液樣本中可得濃度/體積的DNA。此外，納米孔有望大大提高所測序DNA的閱讀長度，從450 個堿基到大于10000個堿基。
[0008] 對于納米孔測序有兩個原理障礙；（1)對于從頭測序缺乏足夠的靈敏度來精確確 定核酸中各核巧酸身份（單核巧酸靈敏度缺乏）；和（2)缺乏在感知期間調(diào)節(jié)各核巧酸單 元通過納米孔的傳輸率的能力。雖然許多研究小組正研發(fā)和改善納米孔W解決障礙1，但沒 有不設(shè)及使用酶或光學(xué)器件的方法來解決障礙2,兩者只能在專口的納米孔技術(shù)中起作用， 并與純粹的電學(xué)方法相比，復(fù)雜性和成本更高。
[0009] 概述
[0010] 在一實施例中，提供一種裝置，包括上室，中間室和下室，其中，所述上室通過第一 孔與所述中間室連通，所述中間室通過第二孔與所述下室連通，其中，所述第一孔和第二孔 的直徑約1納米到約100納米，彼此間隔約10納米至約1000納米，且其中各室包括用于連 接電源的電極。
[0011] 在一方面，所述第一和第二孔大體上是同軸的。
[0012] 在一方面，所述裝置包括選自下組的材料；娃、氮化娃、二氧化娃、石墨締、碳納米 管、Ti〇2、冊〇2、Al2〇3、金屬層、玻璃、生物納米孔、具有生物孔嵌入的膜、及它們的組合。
[0013] 在一方面，所述第一孔和第二孔約0. 3納米至約100納米深。
[0014]在一方面，所述電源配置用于在所述上室和所述中間室之間提供第一電壓，和在 所述中間室和所述下室之間提供第二電壓，且其中所述第一電壓和第二電壓獨立可調(diào)。
[0015] 在一方面，所述電源包括電壓錯系統(tǒng)或膜片錯系統(tǒng)W生成各第一和第二電壓。在 一方面，所述中間室調(diào)整為相對于兩電壓接地。在一方面，所述中間室包括介質(zhì)W便在各孔 和中間室內(nèi)的電極之間提供導(dǎo)電性。
[0016] 在一些方面，所述電源，如電壓錯系統(tǒng)或膜片錯系統(tǒng)，進一步配置用于測量通過各 孔的離子電流。
[0017] 另一實施例提供一種裝置，包括上室，中間室和下室；W及在各室內(nèi)的電極，其中 所述上室通過第一孔與所述中間室連通，所述中間室通過第二孔與所述下室連通，其中，所 述第一孔和第二孔的直徑約1納米到約100納米，彼此間隔約10納米至約1000納米；所述 電極用于連接電壓錯系統(tǒng)或膜片錯系統(tǒng)W便在各孔施加電壓和測量通過各孔的離子電流， 其中所述中間室內(nèi)的電極連接到兩電壓錯或膜片錯系統(tǒng)的共同地線（commonground)。
[0018] 在一個實施例中，還提供一種用于控制荷電聚合物跨孔運動的方法，包括；(a)將 包括荷電聚合物的樣品加載在上述任一實施例中的裝置的上室、中間室或下室之一內(nèi)，其 中所述裝置連接到電壓錯或膜片錯系統(tǒng)W便在所述上室和所述中間室之間提供第一電壓 和在所述中間室和所述下室之間提供第二電壓；化）設(shè)置初始第一電壓和初始第二電壓W 使所述聚合物在諸室之間移動，從而定位通過第一和第二孔的聚合物；W及（C)調(diào)整第一 電壓和第二電壓，W致兩電壓產(chǎn)生作用力W便在受控條件下牽拉所述荷電聚合物離開所述 中間室，從而所述荷電聚合物在一個方向上并W可控的方式移動通過兩個孔，其中，兩電壓 的量值不同。
[0019] 在一方面，通過第一電壓或第二電壓或兩電壓的主動控制或反饋控制建立可控的 傳遞方式，其中任一電壓或兩電壓作為第一或第二或兩離子電流測量值的反饋函數(shù)。非限 定性的例子包括將第二電壓保持恒定，并使用第二離子電流作為用于第一電壓的反饋或主 動控制的反饋，W便在任一方向上可控傳送荷電聚合物。因此，在一方面，基于所測量的通 過所述第二孔的離子電流調(diào)整所述第一電壓。
[0020] 在一方面，將樣品加載到上室中，設(shè)置初始第一電壓將荷電聚合物從上室牽拉至 中間室，設(shè)置初始第二電壓將聚合物從中間室牽拉至下室。
[0021] 在另一方面，將樣品加載到中間室中，設(shè)置初始第一電壓將荷電聚合物從中間室 牽拉至上室，設(shè)置初始第二電壓將荷電聚合物從中間室牽拉至下室。
[0022] 在一方面，荷電聚合物為多核巧酸或多膚。在一方面，荷電聚合物是多核巧酸，例 如，但不限于，雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、單鏈RNA(ssRNA)或 DNA-RNA雜交體。
[0023] 在一方面，在步驟（C)，調(diào)整的第一電壓和第二電壓在量值上是兩電壓間差異的約 10倍至約10000倍。
[0024] 在一方面，所述方法進一步包括當(dāng)聚合物的單體單元穿過其中一孔時，通過測量 穿過該孔的離子電流來識別該單體單元。在一方面，所述單體單元是核巧酸。在另一方面， 所述單體單元是核巧酸對。在一些方面，單核巧酸和核巧酸對可W在一個分子中檢測。例 如，該樣的分子可W在較長和其他單鏈多核巧酸中具有雙鏈體區(qū)段，其中所述雙鏈體區(qū)段 部分或全部通過沃森克里克互補堿基配對形成。
[0025] 在一方面，單體結(jié)合到分子，如DNA結(jié)合蛋白或納米粒子。DNA結(jié)合蛋白的非限制 實例包括RecA和序列特異性DM結(jié)合蛋白，如瞻菌體A阻遏物、NF-kB和p53。納米粒子 的非限制性例子包括量子點和巧光標(biāo)記物。
[0026] 在一方面，聚合物在其一末端附著于固體支持物，如珠。
[0027] 還有的另一實施例提供用于檢測多核巧酸序列的方法，包括；(a)將包括多核巧 酸的樣品加載在任一上述實施例所述裝置的上室內(nèi)，其中所述裝置連接到電壓錯或膜片錯 系統(tǒng)W便在所述上室和所述中間室之間提供第一電壓和在所述中間室和所述下室之間提 供第二電壓，其中所述多核巧酸任選在其一末端連接于固體支持物；化）設(shè)定初始第一電 壓和初始第二電壓，W致所述多核巧酸從所述上室移動到所述中間室，從所述中間室移動 到所述下室，從而定位穿過所述第一孔和第二孔的所述聚合物；（C)調(diào)節(jié)所述第一電壓和 所述第二電壓W致兩電壓產(chǎn)生作用力W便在可控條件下牽拉所述多核巧酸離開所述中間 室，其中所述兩電壓在量值上不同，W致所述多核巧酸在一個方向上W可控方式移動穿過 兩孔；和（d)當(dāng)所述核巧酸穿過孔之一時，通過測量穿過該孔的離子電流識別穿過該孔的 多核巧酸的各核巧酸。
[0028] 附圖簡要描述
[0029] 附圖僅通過舉例的方式描述提供的實施例，其中：
[0030] 圖1訊-(III)示出兩孔（雙孔）裝置。訊用于各孔獨立電壓控制（V。V2)和電 流測量（I。12)的雙孔巧片和雙放大器電子配置的示意圖。除了共同孔，諸室（A-C)在體 積上隔開?？捎玫那善瑓?shù)是孔間距離10-500納米，膜厚度0. 3-50納米，孔徑1-100納 米。（II)電學(xué)上，通過構(gòu)建最大程度降低所有接入電阻W便有效去禪Ii和12的裝置，Vi 和V2主要在各納米孔電阻上。（III)競爭電壓（competingvoltage)將用于控制，藍色箭 頭顯示各電壓作用力（voltage化rce)的方向。假設(shè)孔隙具有相同電壓力影響，用IVII= IV2I+ 5V，調(diào)節(jié)5V值〉0(<0)用于在Vi(V2)方向可調(diào)諧的運動。實際上，對于給定的兩孔 巧片，雖然Vi=V2時各孔的電壓誘導(dǎo)力并不會完全相同，但校準(zhǔn)實驗可確定產(chǎn)生相同牽拉 力所需的電壓偏差，然后可利用圍繞該偏差的變化進行方向控制；和
[0031] 圖2示出具有室A、室B和室C的兩孔殼體裝置的外部視圖，各室具有用于流體進 入和樣本加載的通路。雙孔巧片放置在兩密封墊之間，殼體裝置的各部分具有各密封墊部， 并且兩部分繞較鏈（中間頂部）旋轉(zhuǎn)W在巧片周圍打開和關(guān)閉所述殼體。
[0032] 某些或所有附圖是范例的示意圖，因此，它們不需要描述所示元件的實際相對大 小或位置。為清楚理解示出一個或多個實施例的目的而提供附圖，它們不用于限制后附權(quán) 利要求的范圍或含義。
[003引詳細描述
[0034] 本申請中，文本設(shè)及出現(xiàn)的組成，組合物和方法的各種實施例。描述的各種實施例 意味著提供各種示例性的實施例，不應(yīng)該被解釋為替代品的描述。相反，應(yīng)注意本文所提供 的各種實施例的描述可能是重疊的范圍。本文所討論的實施例僅僅是說明性的，并不意味 著限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 此外本申請中，各種出版物，專利和公布的專利說明書通過引用作為參考。因此該 些出版物，專利和公布的專利說明書的披露內(nèi)容通過引用合并到本申請中W更充分地描述 本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況。
[0036] 如說明書和權(quán)利要求書中所用，除非上下文清楚地另有規(guī)定，單數(shù)形式"一"、"一 個"和"該"包括復(fù)數(shù)形式。例如，術(shù)語"一電極"包括多種電極，包括它們的混合物。
[0037] 如本文所用，術(shù)語"包括"旨在表示裝置和方法包括所列舉的組件或步驟，但不排 除其他的。當(dāng)用于限定裝置和方法時，"基本上由……組成"將意味著從該組合中排除任何 實際意義的其他零件或步驟。"由……組成"將意味著排除其他零件或步驟。該些轉(zhuǎn)換術(shù)語 各自限定的實施例落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[003引全部數(shù)字稱號，例如，距離、尺寸、溫度、時間、電壓和濃度，包括范圍，是近似值，可 改變（+)或（-)0. 1的增量。雖然并不總是明確地指出，但應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語"約"在所有數(shù)值 之前。雖然并不總是明確說明，但還應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的零件僅僅是示例性的，它們的等 價物是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。
[00測雙孔裝置
[0040] 本申請的一個實施例提供兩孔裝置。該裝置包括=個室和使諸室之間流體連通的 兩個孔。此外，各室包括用于連接電源的電極，W便在諸室之間的各孔上產(chǎn)生不同的電壓。
[0041] 依照本申請的一個實施例，提供一種裝置，包括上室、中間室和下室，其中所述上 室通過第一孔與所述中間室連通，并且所述中間室通過第二孔與所述下室連通，其中所述 第一孔和第二孔的直徑約1納米至約100納米，彼此間隔約10納米至約1000納米，且其中 各室包括用于連接電源的電極。
[0042] 參考圖1 (I)，裝置包括上室（室A)，中間室（室B)和下室（室C)。通過各具有獨 立孔（111和112)的兩獨立層或膜（101和102)分隔室。此外，各室包含用于連接電源的 電極（121，122和12：3)。很明顯，上、中間和下室的注釋是相對而言的，并不表示，例如，上室 相