瓜類蔓枯病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測瓜類蔓枯病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組合物，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域，適用于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用?；谠撘锝M合物建立的LAMP 檢測體系可用于從瓜種子檢測瓜類蔓枯病菌，檢測方法易于操作，檢測結(jié)果可靠，且可用肉 眼直接觀察結(jié)果，方便可視。該發(fā)明提供了一組用于檢測瓜蔓枯病菌靈敏、可靠的引物組。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002]瓜蔓枯?。℅ummy Stem Blight，GSB)由瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae)引起， 是萌蘆科作物毀滅性的真菌病害（Zitter，et al.，1996)。1986年，GSB首次報道于歐洲的 萌蘆蔓（野生啤酒花）（Keinath，2010)，目前已廣泛分布在美國、加拿大、荷蘭、瑞典、日本、 印度及中國等地（Li，et al.，2008)。在我國，大多數(shù)西、甜瓜產(chǎn)區(qū)均有GSB發(fā)生的報道， 包括新疆、青海、甘肅、江蘇、浙江、四川以及寧夏等地，嚴重威脅著我國西、甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 (賈菊生，1993 ;馬子林，2013 ;陸致平等，2000 ;趙海棠等，2001 ;胡鳳云等，2011)。
[0003] GSB侵染植物主后主要病癥有：葉片和莖干出現(xiàn)水漬狀壞死斑，后期會被分 生孢子器和假囊殼覆蓋，侵染莖干皮質(zhì)組織潰瘍，并產(chǎn)生一種棕褐色外泌物結(jié)晶（Van Steekelenburg，1986)，病部龜裂，呈淡綠色橢圓形凹陷，后呈灰白色，表面散生黑色小點。 在與植株的互作敏感期（Koch et al.，2002)，壞死斑繼續(xù)擴大最后產(chǎn)生環(huán)狀莖干割束帶 (Grube et al.，2011)，導(dǎo)致整個植株的萎蔫和死亡。瓜蔓枯病菌通產(chǎn)在花期侵染植株，導(dǎo) 致隨后收獲的果實空心或腐爛，其病原菌還可以以分生孢子器、索狀菌絲和子囊殼的形式 伴隨記住殘體埋藏于土壤中越冬（Furukawa，et al.，2007)，更可以使得其余健康種子帶菌 (Kubota，et al.，2011)。相較于溫暖潮濕的環(huán)境更易生長傳播，更可隨風雨等外接因素擴 散傳染，會導(dǎo)致作物大面積死亡減產(chǎn)（Frantz and Jahn，2004)。因此，種子帶菌是GSB遠距 離傳播的主要方式（Caf6 Filho, et al.，2010)。
[0004] 目前，針對瓜蔓枯病菌0). bryoniae)的檢測技術(shù)較少。例如，2006年，戴富明等 以瓜蔓枯病菌（D. bryoniae) ITS為靶標設(shè)計了檢測引物，建立了常規(guī)的PCR檢測體系，該方 法主要適于植株樣品的檢測（戴富明等，2006)。2009年，Ha等報道了基于Real-Time PCR 的瓜蔓枯病菌0. bryoniae)的檢測技術(shù)（Ha，et al.，2009)，但是由于常規(guī)的PCR等檢測 方法易受種子樣品中雜質(zhì)干擾（Walcott and Gitaitis，2000)，而焚光定量PCR技術(shù)需要昂 貴的PCR儀器和試劑，所以該方法不適用于病害的現(xiàn)場診斷和基層部門使用。雖然，GSB田 間發(fā)病癥狀易于識別，但由于其是種傳病害，種子帶菌檢測是有效防止病害發(fā)生最有效地 手段之一，因此，目前急需一種針對瓜蔓枯病菌0). bryoniae)快速、靈敏、簡便、可用于種 子帶菌檢測的現(xiàn)代檢測技術(shù)。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP)是一種新型的檢測技術(shù)，該技術(shù)由Notomi等于2000 年首先報道（Notomi et al.，2000)，該方法在等溫條件下（60-65°C)，加入熒光染料， 45min-60min可實現(xiàn)可視化檢測，具有簡便、敏感、特異、快速的特點。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物 主要由兩條外引物（F3、B3)以及兩條內(nèi)引物（FIP、BIP)組成。檢測原理是利用具有鏈置 換活性的Bst DNA聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物，即正向內(nèi)側(cè)引物(FIP)、正向外側(cè)引物（F3)、反向內(nèi)側(cè)引物（BIP)、反向外側(cè)引物（B3)，特異性識別靶序列上 的6個獨立區(qū)域，在恒溫條件下啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)。在LAMP反應(yīng)中，內(nèi)引物雜交在目標 DNA區(qū)，啟動互補鏈合成，導(dǎo)致啞鈴狀DNA產(chǎn)生。這種結(jié)構(gòu)很快以自身為板，進行DNA合成延 伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，然后以此結(jié)構(gòu)作為的LAMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在 莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的DNA產(chǎn)生一個有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有 目標序列。再通過外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形 成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。
[0006] 迄今，LAMP已廣泛的應(yīng)用于各種微生物檢測（Song et al.，2005 ;Mekata et al.， 2006 ;Endo et al.，2004 ;Lwamoto et al.，2003 ;Lu et al.，2014 ;Fukuta et al.，2013)。 但目前尚未見LAMP技術(shù)用于瓜蔓枯病菌（D.bryoniae)檢測的報道。因此，急需一種針對 瓜蔓枯病菌（D.bryoniae)快速、靈敏、簡便、且可用于種子帶菌檢測的現(xiàn)代檢測技術(shù)。此項 發(fā)明滿足了這些需求。
[0007] 參考文獻
[0008] Cafe-Filho A C，Santos G R，Laranjeira F F. Temporal and spatial dynamics of watermelon gummy stem blight epidemics[J]. European journal of plant pathology，2010 128(4) :473-482.
[0009] Endo S.，Komori T.，Ricci G.，Sano A.，Yokoyama K.，0hori A.，Kamei K.，F(xiàn)ranco M.，Miyaji M.，Nishimura K. Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loop-mdiated isothermal amplification(LAMP)method. FEMS Microbiol Lett 2004. 234：93-97.
[0010] Frantz? J.D. and Jahn? M. M. Five independent loci each control monogenic resistance to gummy stem blight in melon (Cucumis melo L. )Theor Appl Genet (2004) 108：1033-1038.
[0011] Fukuta S，Takahashi R，Kuroyanagi S，et al. Detection of Pythium aphanidermatum in tomato using loop-mediated isothermal amplification(LAMP) with species-specific primers[J].European Journal of Plant Pathology，2013 1-13.
[0012] Furukawa T，Ono Y，Kishi K. Gummy stem blight of balsam pear caused by Didymella bryoniae and its anamorph Phoma cucurbitacearum[J]. Journal of General Plant Pathology，2007 73(2) : 125-128.
[0013] Grube M? Flirnkranz M，Zitzenbacher S，et al. Emerging multi-pathogen disease caused by Didymella bryoniae and pathogenic bacteria on Styrian oil pumpkin[J]. European journal of plant pathology，2011，131(3)：539-548.
[0014]Ha，Y.，F(xiàn)essehaie，A.，Ling，K. S.，Wechter，W. P.，Keinath，A. P.，and Walcott， R. R.2009.Simultaneous detection of Acidovorax avenae subsp.citrulli and Didymella bryoniae in cucurbit seedlots using magnetic capture hybridization and real-time polymerase chain reaction. Phytopathology 99：666-678.
[0015] Keinath? A. P. From native plants in Central Europe to cultivated crops wotldwide ：The emergence of Didymella bryoniae as a cucurb it Pathogen. Cucurbit，(2010). 7-9.
[0016] Koch C A，Utkhede R S. Diagnosis and identification of Didymella bryoniae，causal agent of gummy stem blight of greenhouse cucumbers，using a dot blot technique[J]. Journal of horticultural science&biotechnology，2002,77 (1)： 62-66.
[0017] Li W，Zhang A X，Jiang J，et al. Identification of muskmelon gummy stem blight pathogen and its biological characters[J]. Jiangsu Journal ofAgricultural Science,2008,24(2)：148-152.
[0018]Lu，C.，Dai，T.，Zhang，H.，Wang，Y.，and Zheng，X. 2014. Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay to Detect Fusarium oxysporum.