抗副溶血弧菌ompk卵黃抗體制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種抗副溶血弧菌ompk卵黃抗 體的制備及其快速檢測(cè)應(yīng)用，可用于副溶血弧菌引起的水生動(dòng)物疾病的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著海水養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害頻繁發(fā)生，成為制約養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展 的主要瓶頸之一，其中尤以弧菌病最為嚴(yán)重。業(yè)已證實(shí)，副溶血弧菌等是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主 要病原弧菌，同時(shí)也關(guān)系到水產(chǎn)品質(zhì)量安全。然而，國(guó)內(nèi)還缺乏成熟的弧菌快速檢測(cè)手段以 滿足對(duì)水產(chǎn)疾病控制和水產(chǎn)品安全，特別是早期診斷技術(shù)和手段。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開展了 大量弧菌病免疫檢測(cè)技術(shù)的研宄，但是大多是采用全菌苗制備多克隆抗體或多克隆抗體而 建立的快速檢測(cè)方法，目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開展了大量弧菌病免疫檢測(cè)技術(shù)的研宄，但是大多 是采用多克隆抗體而建立的快速檢測(cè)方法，存在交叉反應(yīng)、特異性和靈敏性等方面的缺陷， 而卵黃抗體具有不同于哺乳動(dòng)物抗體的特殊生物學(xué)特性，尤其是由亞單位疫苗制備的卵黃 抗體具有更好的特異性和靈敏性，在水產(chǎn)動(dòng)物致病弧菌的快速檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前 景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體制備方 法，并作為診斷抗體建立檢測(cè)副溶血弧菌的ELISA方法，用于副溶血弧菌的檢測(cè)與防治。
[0004] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
[0005] -種抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體制備方法，利用副溶血弧菌重組ompk蛋白對(duì) 蛋雞進(jìn)行接種免疫，對(duì)接種后的雞所產(chǎn)的雞蛋在除去蛋白后用蒸餾水漂洗得到純卵黃液， 對(duì)純卵黃液進(jìn)行離心、收集上清液，應(yīng)用飽和硫酸銨溶液沉淀法制備粗制的卵黃抗體，再應(yīng) 用凝膠層析柱進(jìn)一步純化，獲得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體。
[0006] 進(jìn)一步，所述的副溶血弧菌重組ompk蛋白的制備方法，根據(jù)ompk基因序列設(shè)計(jì)引 物，利用所述引物對(duì)抗副溶血弧菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠分離并回收 ompk片段，并用試劑盒純化回收的ompk片段，將純化后的ompk片段、原核表達(dá)載體pET28a 進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶連接ompk酶切回收產(chǎn)物和pET28a酶切回收產(chǎn)物，得到重組陽(yáng)性 質(zhì)粒，將重組陽(yáng)性質(zhì)粒在BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物利用柱層析進(jìn)行純化。
[0007] 進(jìn)一步，所述根據(jù)ompk基因序列設(shè)計(jì)引物：
[0008]上游引物vpl-〇mpk-28a-F:5' -CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3'
[0009] 下游引物vpl-〇mpk-28a-R:5' -CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3'(劃線部分為 Sail酶切位點(diǎn)）。
[0010] 本發(fā)明還提供一種抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體間接ELISA方法，所述方法的 最佳反應(yīng)條件：抗原最適工作濃度濃度為1X108cfu/mL，包被4°C過夜；一抗IgY稀釋度為 l:28;IgY-HRP酶標(biāo)抗體作1:20000稀釋；選擇底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
[0012] 本發(fā)明用高純度副溶血弧菌外膜蛋白o(hù)mpk，與等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化， 免疫健康海蘭蛋雞，每隔10天加強(qiáng)免疫1次，第3次加強(qiáng)免疫后1周開始收集雞蛋。雞蛋 在除去蛋白后用蒸餾水漂洗得到純卵黃液，應(yīng)用飽和硫酸銨溶液沉淀法制備粗體的卵黃抗 體，再應(yīng)用SephadexG-200凝膠層析柱進(jìn)一步純化，所得樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，證實(shí) 獲得精制抗副溶血弧菌外膜蛋白o(hù)mpk的卵黃抗體。本發(fā)明以精制抗副溶血弧菌外膜蛋白 0MPK的卵黃抗體作為檢測(cè)副溶血弧菌的快速檢測(cè)方法，具有較高的專一性和特異性。
[0013] 建立基于IgY的間接ELISA測(cè)定抗原濃度的技術(shù)方法，確定抗原包被濃度、一抗 IgY和酶標(biāo)二抗最適稀釋倍數(shù)，抗原包被條件的選擇，底物的最佳反應(yīng)時(shí)間等間接ELISA的 實(shí)驗(yàn)條件。用建立起來(lái)的間接ELISA檢測(cè)幾種常見的致病性海洋弧菌及常見細(xì)菌：副溶血 弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。發(fā)現(xiàn)只能檢測(cè)到副溶血弧 菌，其他細(xì)菌皆為陰性，表現(xiàn)出了較高的特異性。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1重組0MPK的表達(dá)、純化及Westernblotting檢測(cè)M:Marker1:陰性對(duì)照2: 誘導(dǎo)前3:誘導(dǎo)后4:純化的ompk，5:純化的ompk蛋白Westernblotting檢測(cè)。
[0015] 圖2硫酸銨沉淀純化后IgYSDS-PAGE電泳圖：M蛋白Mark ;1卵黃WSF ;2硫酸銨法 粗提卵黃抗體；
[0016] 圖3IgY的凝膠洗脫圖譜；
[0017] 圖4不同純化階段IgY凝膠電泳圖：M Mark ;1 WSF ;2第一次硫酸銨后；3第二次 硫酸銨后；4凝膠層析后。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不 受實(shí)施例任何形式上的限制。
[0019] -種抗副溶血弧菌OMPK的卵黃抗體制備方法，利用副溶血弧菌重組ompk蛋白對(duì) 蛋雞進(jìn)行接種免疫，對(duì)接種后的雞所產(chǎn)的雞蛋在除去蛋白后用蒸餾水漂洗得到純卵黃液， 對(duì)純卵黃液進(jìn)行離心、收集上清液，應(yīng)用飽和硫酸銨溶液沉淀法制備粗制的卵黃抗體，再應(yīng) 用SephadexG-200凝膠層析柱進(jìn)一步純化，獲得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體。具 體方法如下：
[0020] 1、副溶血弧菌重組ompk蛋白的制備
[0021] (l)PCR引物設(shè)計(jì)
[0022] 根據(jù)ompk基因組序列，利用Primer(Version5. 0)基因分析軟件，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，引物序列如下：
[0023]上游引物vpl-〇mpk-28a-F:5' -CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3' (劃線部分為 EcoRI酶切位點(diǎn)）
[0024]下游引物vpl-〇mpk-28a-R:5' -CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3'(劃線部分為 Sail酶切位點(diǎn)）
[0025] (2)PCR擴(kuò)增、電泳
[0026]以引物vpl-〇mpk-28a-F/vpl-〇mpk-28a-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體制備方法，其特征在于利用副溶血弧菌重組 ompk蛋白對(duì)蛋雞進(jìn)行接種免疫，對(duì)接種后的雞所產(chǎn)的雞蛋在除去蛋白后用蒸餾水漂洗得到 純卵黃液，對(duì)純卵黃液進(jìn)行離心、收集上清液，應(yīng)用飽和硫酸銨溶液沉淀法制備粗制的卵黃 抗體，再應(yīng)用凝膠層析柱進(jìn)一步純化，獲得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的副溶血弧菌重組ompk蛋白的制備 方法，根據(jù)ompk基因序列設(shè)計(jì)引物，利用所述引物對(duì)抗副溶血弧菌的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠分離并回收ompk片段，并用試劑盒純化回收的ompk片段，將純化后 的ompk片段、原核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶連接ompk酶切回收產(chǎn)物和 pET28a酶切回收產(chǎn)物，得到重組陽(yáng)性質(zhì)粒，將重組陽(yáng)性質(zhì)粒在BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表 達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物利用柱層析進(jìn)行純化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述根據(jù)ompk基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引 物vpl-〇mpk-28a-F:5' -CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3' 下游引物vpl-〇mpk-28a-R:5' -CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3'。
4. 一種抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體間接ELISA方法，其特征在于所述方法的反應(yīng)條 件：抗原工作濃度濃度為1X108cfu/mL，包被4°C過夜；一抗IgY稀釋度為1:28;IgY-HRP酶 標(biāo)抗體作1:20000稀釋；選擇底物的反應(yīng)時(shí)間為20min。
【專利摘要】一種抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體制備方法，屬于生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域，它的步驟為利用副溶血弧菌重組ompk蛋白對(duì)蛋雞進(jìn)行接種免疫，對(duì)接種后的雞所產(chǎn)的雞蛋在除去蛋白后用蒸餾水漂洗得到純卵黃液，對(duì)純卵黃液進(jìn)行離心、收集上清液，應(yīng)用飽和硫酸銨溶液沉淀法制備粗制的卵黃抗體，應(yīng)用飽和硫酸銨溶液沉淀法制備粗制的卵黃抗體，再應(yīng)用凝膠層析柱進(jìn)一步純化，獲得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黃抗體。本發(fā)明以精制抗副溶血弧菌OMPK的卵黃抗體作為檢測(cè)副溶血弧菌的快速檢測(cè)方法，具有較高的專一性和特異性。
【IPC分類】C12N15-31, C12N15-70, C07K16-12, C07K16-02, G01N33-569
【公開號(hào)】CN104710530
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510118068
【發(fā)明人】閆茂倉(cāng), 王雪鵬, 胡偉麗, 張賽樂, 郝金婷
【申請(qǐng)人】浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日