件的極少發(fā)生排除了圖9E中的大部分 負(fù)Vexit是由非特異性探針-靶結(jié)合或由探針對(duì)孔的結(jié)合所引起這種可能性。
[0032]圖 10A-10C比較了MIMspA與M2MspA孔蛋白的dT50(SEQIDN0:32)均聚物阻塞。 圖10A是實(shí)驗(yàn)的示意圖。圖10B顯示了對(duì)于利用8yMdT50(左）的MIMspA孔蛋白和利用 2yMdT50(右）的M2MspA孔蛋白觀察到的代表性離子電流信號(hào)。圖10C顯示在放大的時(shí) 標(biāo)上來自圖10B中的描記線的已編號(hào)的阻塞。
[0033] 圖11顯示M2MspA孔蛋白中dT50(SEQIDN0:32)阻塞的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征。在阻塞開 始和結(jié)束時(shí)平均結(jié)構(gòu)的比較。通過重疊事件開始時(shí)（左）和事件結(jié)束時(shí)（右）對(duì)齊的數(shù)據(jù) 文件中的事件來產(chǎn)生圖。顯示了阻塞以離子電流的短暫向下偏轉(zhuǎn)終止的趨勢(shì)以及該趨勢(shì)隨 電壓升高而增加。
[0034] 圖12A顯示被DNA構(gòu)建體阻塞的MIMspA孔蛋白中阻塞電流水平的直方圖。DNA 構(gòu)建體從上至下為：3'-A47AAC-hp-5'（SEQIDN0:14) ;3'-A47ACA-hp-5'（SEQIDN0:33); 3'-A47CAA-hp-5'（SEQIDN0:13) ;3'-C5(l-hp-5'（SEQIDN0:16) ;3'-A5(l-hp-5'（SEQID N0:10)。圖12B顯示針對(duì)poly-C( = 1.0)與poly-A( = 0?0)水平之間的差異標(biāo)度的電流 水平對(duì)單個(gè)C的位置的曲線。高斯擬合表明對(duì)于單個(gè)C的識(shí)別位置距離發(fā)夾末端1. 7±0. 8 個(gè)核苷酸（nt)。
[0035] 圖13顯示許多阻塞Ml-NNNMspA(也稱為MIMspA)孔蛋白的DNA的電流直方 圖。0嫩構(gòu)建體從上到下為：3'-(：5。-1^-5'（5￡〇10勵(lì)：16);3'-六 5。-1^-5'（5￡〇10勵(lì)：10); 3'-T47TTT-hp-5'（SEQIDN0:17) ;3'-A47AAT-hp-5'（SEQIDN0:34) ;3'-A47ATA-hp-5'（SEQ IDN0:35) ;3，-A47TAA-hp-5,（SEQIDN0:36) ;3，-C47CCA-hp-5,（SEQIDN0:37); 3'-C47CAC-hp-5'（SEQIDN0:38) ;3'-C47ACC-hp-5'（SEQIDN0:39)。每一個(gè)構(gòu)建體或混合 物示于左邊。每一個(gè)直方圖中事件的數(shù)量示于右邊。上圖：〃校準(zhǔn)混合物〃(poly-A-hp和 poly-C-hp)。圖2-5:Poly-T_hp和poly-A背景中的單個(gè)T喊基。下方三個(gè)圖：poly_A背 景中的單個(gè)A堿基。Poly-A-hp包含在用于參照的混合物中（小峰值在19. 5%上）。全部 數(shù)據(jù)采用180mV。
[0036] 圖14顯示DNA尾不影響識(shí)別性質(zhì)。圖例是關(guān)于圖13的。兩個(gè)非均質(zhì)尾 ('ranl'（SEQIDN0:51)、'ran2'（SEQIDN0:52)，各自47個(gè)堿基）連接至三核苷酸和發(fā) 夾。中間的圖顯示當(dāng)將A50-hpDNA(SEQIDN0:10)與ranl-C3-hpDNA的混合物用于孔時(shí) 產(chǎn)生的電流直方圖，其為其他圖的參照點(diǎn)。電流水平與A50或C50尾的電流水平相同。全 部數(shù)據(jù)采用180mV。
[0037]圖15A和15B顯示M2-QQN孔蛋白（另一種突變的MspA孔蛋白）的表征數(shù)據(jù)。圖 15A顯示了該突變體的表達(dá)水平。全部蛋白質(zhì)在ML16恥垢分枝桿菌中表達(dá)。將10y1 0. 5% 辛基聚氧乙?。╫ctylpolyoxyethylene)粗制提取物加入每一個(gè)孔。泳道1:WTMspA;泳道 2:背景（pMS2,空載體）；泳道3:M2-QQN(pML866)。圖15B顯示在1MKC1中記錄的二植烷 酰磷脂酰膽堿（diphytanoylphosphatidylcholine)脂雙層中的M2-QQN孔蛋白的電流描記 線。將大約70pg的蛋白質(zhì)加入至雙層小室。在脂雙層實(shí)驗(yàn)中分析4個(gè)膜的約100個(gè)孔。 M2-QQN孔蛋白的主電導(dǎo)（mainconductance)為 2. 4 納秒（nS)。
[0038] 圖 16 顯示關(guān)于暴露于hp-T50(SEQIDN0:17)、hp-C50(SEQIDN0:16)和 hp-A50(SEQIDN0:10)的發(fā)夾DNA混合物的3種不同突變MspA孔蛋白的阻塞電流直方 圖。在每一種情況下，對(duì)于每一個(gè)突變體，將電流針對(duì)右邊顯示的開放態(tài)電流（openstate current)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將hp-C50和hp-A50作為混合物使用，而T50單獨(dú)使用。
[0039] 圖17是顯不兩種突變MspA孔蛋白的株度電流阻塞的存在概率。顯不了比t持續(xù) 更長(zhǎng)的事件的概率。圓圈表示M2-QQN孔蛋白，十字形表示M2-NNN孔蛋白。雙層兩側(cè)施加 的電壓是100、120和140mV。將數(shù)據(jù)針對(duì)每一個(gè)記錄中的事件總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。
[0040] 圖18顯示恥垢分枝桿菌的MspA、MspB、MspC和MspD單體的比對(duì)。開放閱讀框架 的第一ATG或GTG密碼子被當(dāng)作假定的起始密碼子。蛋白質(zhì)的編號(hào)始于成熟部分的第一個(gè) 氨基酸。MspA單體氨基酸序列是SEQIDN0:28，MspB單體氨基酸是SEQIDN0:29，MspC 單體氨基酸是SEQIDNO: 30,以及MspD單體氨基酸序列是SEQIDNO: 31。
[0041] 圖19是顯示恥垢分枝桿菌孔蛋白-四重突變體（quadruplemutant)ML59中每一 個(gè)孔蛋白基因的缺失的凝膠圖像。
[0042] 圖20顯示顯示Msp孔蛋白在恥垢分枝桿菌中表達(dá)和恥垢分枝桿菌孔蛋白突變體 的Western印跡。泳道1是1:10稀釋的野生型恥垢分枝桿菌的蛋白質(zhì)提取物，泳道2是突 變體MN01 (AmspA)，泳道3是突變體ML10 (AmspAC)，泳道4是突變體ML16 (AmspACD)， 以及泳道5是突變體ML180 (AmspABCD)。
[0043] 圖21A和21B顯示用于四重孔蛋白突變體的構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜。Hyg:潮霉素抗性 基因；ColEl:大腸桿菌（E.coli)復(fù)制起始點(diǎn)。圖21A是用于MspA表達(dá)的整合質(zhì)粒圖譜。 AmiC、A、D、S是MspA的乙酰胺誘導(dǎo)型表達(dá)所必需的。attP:噬菌體L5的染色體附著位 點(diǎn)；int:L5整合酶；FRT:Flp重組酶位點(diǎn)。圖21B是MspB缺失載體的質(zhì)粒圖譜。MspBup、 MspBdown:MspB的上游和下游區(qū)域；loxP:Cre重組位點(diǎn)；SacB:鹿糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶； 父7正：兒茶酚-2,3-雙加氧酶；6€口2+ :綠色熒光蛋白4#415000:分枝桿菌的溫度敏感型 復(fù)制起點(diǎn)。
[0044] 圖22是顯示恥垢分枝桿菌中MspA單體的誘導(dǎo)型表達(dá)的考馬斯藍(lán)染色凝膠的圖 像。
[0045] 圖23是顯示Msp四重突變體ML705在Middlebrook7H10瓊脂板上生長(zhǎng)的圖像。
[0046] 圖24是顯示ML705在豐富液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)率的照片。
[0047] 圖25是顯示在用乙酰胺誘導(dǎo)后MspA單體在四重突變體ML705中的表達(dá)的 Western印跡圖像。泳道1是野生型恥垢分枝桿菌，泳道2是利用乙酰胺的四重突變菌 株ML705,泳道3是不使用乙酰胺的四重msp突變菌株ML705,以及泳道4是三重突變菌株 ML16。使用針對(duì)MspA的多克隆抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)。
[0048] 圖26A-26D顯示單鏈MspA納米孔二聚體的結(jié)構(gòu)和通道活性。圖26A是單鏈納米孔 MspA二聚體的分子模型的圖像。圖26B顯示單鏈MspA納米孔二聚體（scMspA)基因構(gòu)建體 的示意圖。氨基酸連接體區(qū)域（GGGGS)3(SEQIDN0:3)被放大。還顯示了氨基酸連接體的 DNA序列（5'-GGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGC-3'）（SEQIDN0:19)。 圖26C是顯示scMspA納米孔二聚體在恥垢分枝桿菌中表達(dá)的Western印跡的圖像。泳道1 是分子量標(biāo)準(zhǔn)（M)，泳道2是野生型恥垢分枝桿菌（WTMsmeg)，泳道3是無scMspA基因構(gòu)建 體（ML16)的ML16菌株，泳道4是具有野生型MspA基因構(gòu)建體（WTMspA)的ML16菌株，泳 道5是具有scMspA納米孔二聚體基因構(gòu)建體（scMspA)的ML16菌株。圖26D顯示scMspA 納米孔二聚體的電流描記線。
[0049] 圖27顯示運(yùn)輸dC58(SEQ ID N0:40) ssDNA通過野生型MspA孔蛋白的示意圖。DNA 運(yùn)輸由下列步驟組成：a)開始模擬；b)和c)在快速前進(jìn)之前和之后DNA構(gòu)象改變；和d) DNA附著至MspA孔蛋白的表面。
[0050] 圖28是顯示圖27的dC58(SEQIDN0:40)ssDNA運(yùn)輸?shù)睦鄯e離子電流的圖。在 1. 2V的跨膜偏壓下進(jìn)行運(yùn)輸。
[0051] 圖29顯示單鏈MspA(scMspA)納米孔八聚體序列的設(shè)計(jì)。scMspA八聚體由下述組 成：野生型MspA基因單體、MspAl單體、MspA2單體、MspA3單體、MspA4單體、MspA5單體、 MspA6單體和MspA7單體組成。PacI和Hindlll限制性位點(diǎn)側(cè)翼連接scMspA納米孔八聚 體序列。X1-X14是側(cè)翼連接單個(gè)單體序列的唯一限制性位點(diǎn)。連接每一個(gè)單體的黑線表示 (GGGGS)3(SEQIDN0:3)連接體。
[0052] 圖30顯示野生型MspA單體和多種MspA旁系同源物和同系物單體的縊縮區(qū)（矩 形框）。
[0053] 圖31顯示被DNA構(gòu)建體阻塞的MIMspA中的阻塞電流水平的直方圖。DNA構(gòu)建 體從上至下為：3' -A4(lAAAAAAAAAA-hp-5'（SEQIDN0:10) ;3' -A4(lCCCCAAAAAA-hp-5'（SEQ IDN0:11) ;3'-A40AAACCCCAAA-hp-5'（SEQIDN0:12) ;3'-A40AAAAAAACAA-hp-5'（SEQID N0:13) ;3'-A4(lAAAAAAAAAC-hp-5'（SEQIDN0:14) ;3'-A4(lAAAAAACCCC-hp-5'（SEQID N0:15);3'-C40CCCCCCCCCC-hp-5'（SEQIDN0:16);3'-T4〇TTTTTTTTTT-hp-5'（SEQID NO: 17) ；3'-A40AAAAAAAGGG-hp-5'(SEQIDN0:18)〇
[0054] 發(fā)明詳述
[0055] 本文中提供了方法，其包括對(duì)具有界定通道的前廳和縊縮區(qū)的恥垢分枝桿菌孔蛋 白（Msp)孔蛋白施加電場(chǎng)，其中所述Msp孔蛋白位于第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介 質(zhì)之間。任選地，所述第一和第二液體導(dǎo)電介質(zhì)相同。任選地，所述第一和第二液體導(dǎo)電介 質(zhì)不同。Msp孔蛋白可以是本文中描述的任何Msp孔蛋白。例如，Msp孔蛋白可選自野生 型MspA孔蛋白、突變的MspA孔蛋白、野生型MspA旁系同源物或同系物孔蛋白以及突變的 MspA旁系同源物或同系物孔蛋白。
[0056] 在本文中的任何實(shí)施方案中，Msp孔蛋白還可包含分子發(fā)動(dòng)機(jī)（motor)。所述分子 發(fā)動(dòng)機(jī)可以能夠以這樣的轉(zhuǎn)位速度或平均轉(zhuǎn)位速度將分析物移入或穿過通道，所述速率小 于分析物在分子發(fā)動(dòng)機(jī)不存在的情況下通過電泳轉(zhuǎn)位入或穿過通道時(shí)的轉(zhuǎn)位速度或平均 轉(zhuǎn)位速度。因此，在本文中的包括施加電場(chǎng)的任何實(shí)施方案中，電場(chǎng)可能足以使分析物通過 電泳轉(zhuǎn)位通過通道。
[0057] 本文中所述的任何液體介質(zhì)例如導(dǎo)電液體介質(zhì)可包含分析物。分析物可以是本文 中所述的任何分析物。本文中的實(shí)施方案還可包括在例如下述方法中檢測(cè)分析物，所述方 法包括當(dāng)分析物與Msp孔蛋白通道相互作用時(shí)測(cè)量離子電流以提供電流模式，其中電流模 式中阻塞的出現(xiàn)標(biāo)示著分析物的存在。
[0058] 任選地，Msp孔蛋白是突變的MspA或突變的MspA旁系同源物或同系物孔蛋白， 并且分析物的穿過孔蛋白通道的轉(zhuǎn)位速度或平均轉(zhuǎn)位速度小于或大于分析物穿過野生型 MspA或野生型MspA旁系同源物或同系物孔蛋白的通道的轉(zhuǎn)位速度或平均轉(zhuǎn)位速度。
[0059] 在本文中的任何實(shí)施方案中，分析物可具有小于0. 5nm/ys的穿過通道的轉(zhuǎn)位速 度或平均轉(zhuǎn)位速度。任選地，分析物可具有小于〇.