一種培養(yǎng)瓶及其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種培養(yǎng)瓶，本發(fā)明還涉及一種培養(yǎng)瓶的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病原菌能弓I起多種感染和傳染病，對病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測和鑒定可以為疾病的診斷、治療及流行病調(diào)查提供有效的依據(jù)。隨著抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致出現(xiàn)大量嚴(yán)重耐藥菌株以及新的病原微生物的出現(xiàn)，給臨床診斷和治療帶來了極大的困擾，這也給病原微生物的檢測和診斷提出來更高的要求。對血液樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和檢測是診斷血液感染類疾病的必須措施。由微生物侵犯血液引起敗血癥和菌血癥是臨床上的危急病癥，死亡率高達(dá)29%。據(jù)權(quán)威資料統(tǒng)計(jì)，近20年來血液感染的發(fā)生率明顯增加，已由上世紀(jì)70年代的6%上升至21世紀(jì)初期的13%，目前仍處于上升趨勢。對于血液感染性疾病患者，能否有效治愈，很大程度上決定于快速、及時、準(zhǔn)確的細(xì)菌培養(yǎng)檢測報(bào)告。過去一直沿用傳統(tǒng)手工培養(yǎng)檢測方法，靜態(tài)培養(yǎng)、肉眼觀察，存在微生物生長差、培養(yǎng)時間過長(7天甚至更長)、陽性率檢出低、準(zhǔn)確性差、污染率高等缺點(diǎn)，往往延誤冶療，已不能適應(yīng)現(xiàn)代臨床醫(yī)療的需要。
[0003]血培養(yǎng)主要通過監(jiān)測培養(yǎng)基中的渾濁度、pH值、代謝終產(chǎn)物CO2的濃度、熒光標(biāo)記底物或代謝產(chǎn)物等的變化，定性地檢測微生物的存在。當(dāng)前得到應(yīng)用的血培養(yǎng)方法有以下幾種，一是檢測培養(yǎng)基的導(dǎo)電性和電壓改變:血培養(yǎng)基中因含有不同電解質(zhì)而具有一定導(dǎo)電性。微生物在生長代謝的過程中可產(chǎn)生質(zhì)子、電子和各種帶電荷的原子團(tuán)(例如在液體培養(yǎng)基內(nèi)CO2轉(zhuǎn)變成HCO3-)，通過電極檢測培養(yǎng)基的導(dǎo)電性或電壓可判斷有無微生物生長，這一方法需要采用較精密的電學(xué)儀器進(jìn)行檢測。二是測定培養(yǎng)瓶內(nèi)壓力變化:許多細(xì)菌生長過程中，常伴有吸收或產(chǎn)生氣體現(xiàn)象，如很多需氧菌在胰酶消化大豆肉湯中生長時，由于消耗培養(yǎng)瓶中的氧氣而首先表現(xiàn)為吸收氣體，而厭氧菌生長時最初均無吸收氣體現(xiàn)象，僅表現(xiàn)為產(chǎn)生氣體(主要為CO2),因此可利用培養(yǎng)瓶內(nèi)壓力的改變檢測微生物的生長情況，這一方法也需要采用壓力測試設(shè)備進(jìn)行。三是采用光電原理監(jiān)測培養(yǎng)基PH改變:微生物在代謝過程中必然會產(chǎn)生終代謝產(chǎn)物CO2，引起培養(yǎng)基pH值及氧化還原電位改變。利用光電比色檢測血培養(yǎng)瓶中某些代謝產(chǎn)物量的改變，可判斷有無微生物生長，這一方法檢測相對復(fù)雜。四是采用同源熒光技術(shù)來監(jiān)測微生物的生長:與培養(yǎng)基結(jié)合的熒光分子在最初具有一定熒光值，當(dāng)有微生物存在時，其生長代謝過程中或產(chǎn)生CO2、或發(fā)生pH值改變、或氧化還原使電位改變等，均可導(dǎo)致液體培養(yǎng)基內(nèi)的熒光分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而成為無熒光的化合物，即發(fā)生熒光衰減。通過光電比色計(jì)檢測熒光衰減水平，可判斷有無微生物生長，該方法同樣需要采用昂貴的自動檢測儀。
[0004]綜上所述的幾種方法，均在檢測方式，或者檢測精度，以及檢測的及時性上等，都存在不少問題，因此亟待提出一種新方法來解決這些問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種基于熒光和化學(xué)傳感膜技術(shù)的微生物培養(yǎng)瓶，既可以采用全自動檢測儀進(jìn)行檢測，也可以通過目測來判斷微生物生長，提高培養(yǎng)速度，靈敏度聞、結(jié)構(gòu)簡單等。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種基于熒光和化學(xué)傳感膜技術(shù)的微生物培養(yǎng)瓶的制備方法，其制備方法簡單，易于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)瓶的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種培養(yǎng)瓶，包括瓶體、瓶蓋、膠塞；其中，所述瓶體內(nèi)預(yù)分裝有液體培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基中混懸有吸附樹脂，所述瓶體內(nèi)部底端貼敷一層傳感膜，所述傳感膜含有熒光指示劑及化學(xué)指示劑，當(dāng)瓶內(nèi)微生物的生長繁殖時，不僅能使所述傳感膜發(fā)生顏色變化，而且發(fā)生熒光改變。
[0010]優(yōu)選的是，所述液體培養(yǎng)基為需氧菌、厭氧菌和真菌培養(yǎng)所需的胰酶大豆肉湯或腦心浸液等培養(yǎng)成分，并添加適當(dāng)微生物促生長因子，使細(xì)菌快速繁殖生長，便于快速檢測。
[0011]優(yōu)選的是，所述吸附樹脂為一種或多種非離子吸附樹脂和弱酸性陽離子樹脂，將所述吸附樹脂混懸于所述液體培養(yǎng)基中，用以快速地吸附檢測樣本中所含有的抗生素，降低抗生素對血培養(yǎng)的負(fù)面影響，提高陽性檢出率。
[0012]優(yōu)選的是，所述傳感膜，為高分子半透膜，其只允許分子量為200以下的物質(zhì)通過，避免非相關(guān)物質(zhì)的干擾。
[0013]優(yōu)選的是，所述化學(xué)傳感膜，采用高分子硅橡膠材料制備。
[0014]優(yōu)選的是，所含熒光指示劑為熒光素類、羅丹明類、金屬配合物類和卟啉類熒光物質(zhì)的任一種；所含化學(xué)指示劑為百里酚藍(lán)、酚紅、甲酚紅、溴百里酚藍(lán)中的任一種或多種。
[0015]優(yōu)選的是,所述突光指示劑和所述化學(xué)指示劑的組合包括:
[0016]0.01%-0.05% 的羅丹明 101,0.1%_0.5% 的百里酚藍(lán)；
[0017]0.02%-0.04% 的羅丹明 Β、0.2%_0.4% 的百里酚藍(lán)；
[0018]0.01%-0.03% 的羅丹明 101,0.01%_0.05% 的溴百里酚藍(lán)；
[0019]0.02%-0.06%的銪配合物、0.03%_0.08%的溴百里酚藍(lán)；
[0020]0.03%-0.05%的釕配合物、0.02%_0.04%的甲酚紅，以上含量均為各組分在所述傳感膜中的質(zhì)量百分比。
[0021]優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)瓶內(nèi)密閉空間為無菌環(huán)境，并含有混合氣體，。
[0022]優(yōu)選的是，所述有混合氣體，為氧氣、氮?dú)?、氫氣、二氧化碳中的兩種或更多種氣體，提供微生物生長的必須條件。
[0023]優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)瓶瓶體為無色透明圓柱形塑料容器，采用聚酯材料制備而成。
[0024]優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)瓶瓶蓋為雙層鋁制，頂層設(shè)有不同顏色的噴涂層，從而通過用不同顏色噴涂以區(qū)分培養(yǎng)瓶的類別；而頂層的存在表示培養(yǎng)瓶尚未啟封，不存在則表示已啟封。
[0025]優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)瓶膠塞為丁基橡膠塞，用以確保培養(yǎng)瓶的氣密性。
[0026]一種培養(yǎng)瓶的制備方法，包括如下步驟:
[0027]①傳感膜的制備:
[0028]將熒光指示劑及化學(xué)指示劑分別用溶劑溶解稀釋，分別適量加入液體高分子硅橡膠中，攪勻均勻，真空脫氣15-20分鐘，用設(shè)備按照每瓶3-4克質(zhì)量灌注于空培養(yǎng)瓶底部，經(jīng)20-24小時室溫固化；
[0029]②液體培養(yǎng)基的制備:
[0030]用純化水按比例溶解所需的胰酶大豆肉湯或腦心浸液等培養(yǎng)成分，并添加適當(dāng)微生物促生長因子，高壓濕熱滅菌處理，冷卻后分裝于已制備好傳感膜的空瓶內(nèi)，每瓶40ml ；
[0031]③吸附樹脂的分裝:
[0032]將滅菌處理后的非離子吸附樹脂和弱酸性陽離子樹脂按照配比混勻，按照每瓶1-2克質(zhì)量灌注于已分裝液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)；
[0033]④封裝:
[0034]用設(shè)備注入內(nèi)置混合氣體，壓上預(yù)先滅菌的膠塞和瓶蓋，鎖死密封。
[0035]優(yōu)選地，所述步驟①中熒光和化學(xué)指示劑為羅丹明101和百里酚藍(lán)，以其在傳感膜中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，0.01%-0.05%的羅丹明101、0.1%-0.5%的百里酚藍(lán)。
[0036]優(yōu)選地，所述步驟①中熒光和化學(xué)指示劑也可以采用羅丹明B和百里酚藍(lán)，以其在傳感膜中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，0.02%-0.04%的羅丹明B、0.2%-0.4%的百里酚藍(lán)。
[0037]優(yōu)選地，所述步驟①中熒光和化學(xué)指示劑也可以采用羅丹明101和溴百里酚藍(lán)，以其在傳感膜中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，0.01%-0.03%的羅丹明101、0.01%-0.05%的溴百里酚藍(lán)。
[0038]優(yōu)選地所述步驟①中熒光和化學(xué)指示劑也可以采用金屬銪配合物和溴百里酚藍(lán)，以其在傳感膜中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，0.02%-0.06%的銪配合物、0.03%-0.08%的溴百里酚藍(lán)。
[0039]優(yōu)選地，所述步驟①中熒光和化學(xué)指示劑也可以采用金屬釕配合物和甲酚紅，以其在傳感膜中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，0.03%-0.05%的釕配合物、0.02%-0.04%的甲酚紅。
[0040]根據(jù)以上制備方法制備的培養(yǎng)瓶在檢測生物樣品中的應(yīng)用，檢測對象為血液或體液中厭氧菌、需氧菌和真菌的含量。
[0041]本發(fā)明的所述培養(yǎng)瓶，基于熒光和化學(xué)傳感膜技術(shù)，可以通過全自動血培養(yǎng)檢測儀，自動檢測瓶底所述傳感膜因瓶中微生物生長繁殖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，膜內(nèi)的熒光指示劑和化學(xué)指示劑根據(jù)代謝產(chǎn)物的變化產(chǎn)生熒光強(qiáng)度和傳感膜顏色的變化，檢測儀據(jù)此變化判定微生物的生長。
[0042]本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是:本發(fā)明一方面提出一種基于突光和化學(xué)傳感膜技術(shù)的微生物所述培養(yǎng)瓶，同時實(shí)現(xiàn)傳感膜顏色和熒光的變化，克服了僅靠顏色變化的傳感膜微生物檢測速度慢的問題，也克服了僅靠熒光變化不能目測、需依賴昂貴自動檢測儀的問題，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，將儀器檢測與人工目測合二為一，進(jìn)行微生物培養(yǎng)時可在瓶外清晰觀測微生物生長情況，也可通過儀器實(shí)現(xiàn)連續(xù)檢測，大大提高了血培養(yǎng)的速度，具有靈敏度高、特異性好，縮短陽檢出時間等優(yōu)點(diǎn)；另一方面提出一種基于熒光和化學(xué)傳感膜技術(shù)的微生物培養(yǎng)瓶的制備方法，其制備方法簡單，易于大規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0043]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0044]圖1為本發(fā)明一種培養(yǎng)瓶結(jié)構(gòu)示意圖，圖中I瓶體；2瓶蓋；3膠塞；4液體培養(yǎng)基；5吸附樹脂；6熒光和化學(xué)傳感膜。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0046]本發(fā)明總的技術(shù)方案如下:
[0047]如圖1所不:一種培養(yǎng)瓶,包括瓶體1、瓶蓋2、膠塞3、液體培養(yǎng)基4、吸附樹脂5、傳感膜6。其中，培養(yǎng)瓶瓶體I為無色透明圓柱形塑料容器，內(nèi)部為無菌環(huán)境。瓶蓋2為雙層鋁制，頂層用不同顏色噴涂以區(qū)分培養(yǎng)瓶的類別。頂層的存在表示培養(yǎng)瓶尚未啟封，不存在則表示已啟封。膠塞3為丁基橡膠塞，用以確保培養(yǎng)瓶的氣密性。瓶內(nèi)預(yù)分裝有液體培養(yǎng)基4,液體培養(yǎng)基為需氧菌、厭氧菌和真菌培養(yǎng)所需的胰酶大豆肉湯或腦心浸液等培養(yǎng)成分，并添加適當(dāng)微生物促生長因子，是細(xì)菌的快速繁殖生長，便于快速檢測。培養(yǎng)基4中混懸有吸附樹脂5，吸附