一種分析醬油曲醅中未知微生物的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明尤其設及一種微生物的分析方法，特別是設及一種分析醬油酷中未知微生 物的方法；具體是設及醬油的生產制曲和發(fā)酵過程分析并進行監(jiān)控外來微生物的污染的方 法，。屬于醬油生產領域。
【背景技術】
[0002] 中國傳統(tǒng)醬油的生產，制曲及發(fā)酵過程都是敞開式的，許多有益的微生物和有害 微生物都參與其中，其所起到的好壞作用不清楚，目前通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分析方法只了解到 其中一部分微生物，還有很多有益或有害微生物仍不清楚。因為傳統(tǒng)的微生物學研究方法 是借鑒于需要從環(huán)境中分離和純培養(yǎng)微生物，在其形態(tài)、生理生化特征和代謝等方面加W 分析。然而，自然界中各種微生物都混雜生活在一起，即使很少量的樣品也是許多微生物共 存的群體，要分離某種微生物，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)?，F(xiàn)有的方法：稀釋涂布 平板法、稀釋混合平板法或平板劃線法是分離和純化微生物的常規(guī)方法，但許多研究已經 證實，該方法一般僅能培養(yǎng)和分離出占總數(shù)1%的極少數(shù)微生物，由于微生物之間復雜的共 生關系和培養(yǎng)條件，有多達99%的微生物不能在實驗室條件下培養(yǎng)和分離，遠遠不能滿足 微生物生態(tài)學研究的需要，而且更難W及時有效地跟蹤微生物群落結構的變化過程。它最 大的缺點是；即使最復雜的實驗組合也不能對分離物進行精確的鑒定，而且不能揭示分離 物之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，種屬分類的準確性不高，導致微生物資源大量丟失。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明針對現(xiàn)有傳統(tǒng)培養(yǎng)技術存在的問題和醬油發(fā)酵過程各種微生物混雜特性， 目的在于客服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種種屬分類的準確性高的分析醬油曲酷中未知微生 物的方法。
[0004] 本發(fā)明適用于所有生產工藝的醬油的各個發(fā)酵階段醬油曲酷中微生物群落分析， 利用構建的細菌leSrDNA V3區(qū)通用引物，建立了醬油曲酷中微生物結構的技術分析體系， 具有無需分離培養(yǎng)過程、快速、方便、全面、重復性好等優(yōu)點。發(fā)酵曲料中微生物群落結構和 動力學變化規(guī)律可W成為傳統(tǒng)釀造業(yè)改造的突破口，不僅可W深入分析純種微生物的發(fā)酵 生產工藝，而且能夠深入分析傳統(tǒng)釀造中的群體微生物在發(fā)酵生產過程所起的作用，分析 出影響傳統(tǒng)發(fā)酵食品的質量問題和安全問題。
[0005] 本發(fā)明目的通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0006] 一種分析醬油曲酷中未知微生物的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)樣品的采集；在醬油發(fā)酵罐采集樣品，在醬油發(fā)酵周期分時間段進行采樣；
[000引 2)從采集的醬油酷中提取基因組DNA ;
[0009] 3)建立擴增16S rDNA V3可變區(qū)的PCR反應體系和反應程序，用瓊脂糖凝膠電泳 檢測PCR產物，用GelDoc 2000System凝膠成像儀拍照，分析結果；擴增所用的引物為SE化 ID. N01 和沈化 ID. N02 ;
[0010] 4)PCR產物的純化；
[001U 5)對上述純化后的PCR產物進行變性梯度凝膠電泳，電泳結束后，用SYBR GREEN 染色，用凝膠成像儀拍照；
[0012] 6)采用如antity one軟件對圖譜進行多樣性分析和聚類分析；
[0013] 7)對圖譜上的優(yōu)勢條帶和差異條帶進行切膠回收；
[0014] 8)對回收條帶進行PCR擴增，擴增所用的引物為SE化ID. N03和SE化ID. N02 ;
[00巧]9)擴增產物用來做測序分析，測序反應所用的引物為SE化ID. N03和SEA ID. N02 ；
[0016] 10)所測得的序列經于NCBI上進行Blast比對分析，然后進行同源性分析。
[0017] 進一步地，所述采集樣本的采樣位置為發(fā)酵罐的中層曲膠和頂層曲膠。
[001引所述采用的時間為發(fā)酵的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第75天和 第90天。
[0019] 所述提取基因組DNA用醬油類DNA提取試劑盒提取醬油酷樣品基因組DNA，該方法 能較好地去除大豆蛋白，降低鹽分和色素的含量。
[0020] 所述步驟（3)中反應體系組成為；總體積50 y 1，包括DNA模板6 y L，正反引物各 luLEx Taq Primx(該混合液包括 Ex 化9、（1腫？ Mix1:ure 和 Ex Taq Buffer)25lil，加 dd&O 至 50 y 1。
[002U 所述步驟（3)中PCR的反應程序為降落PCR,預變性94°C 4min，前20個循環(huán)為： 94°C變性Imin，65°C退火Imin，每個循環(huán)后退火溫度下降0. 5°C，72°C延伸Imin ;再于恒定 退火溫度下進行10個循環(huán)，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸Imin，最后再72°C延 伸5min，于4°C保存。
[002引 所述步驟（4)采用 TaKaRa 公司的 DNA Rra卵ent Purification Kit Ver. 2. 0 試 劑盒純化PCR產物。
[0023] 所述步驟（5)中進行變性梯度凝膠電泳的條件為：采用8%的丙締酷胺凝膠濃度， 上樣量為20 y以電壓60v，60°C，電泳時間為3.化。
[0024] 所述步驟（5)中的染色方法為：將凝膠從玻璃板上剝離，放入1:10000體積比稀釋 的SYBRGREEN染色緩沖液中，避光染色20分鐘。
[002引步驟做中反應體系組成為；總體積50 y 1，包括DNA模板6 y L，正反引物各1 y L， Ex Taq Primx(該混合液包括 Ex 化9、(1腫？ Mix1:ure 和 Ex Taq 6證'日1')25^1，加（1地20至 50 y 1，擴增所用的引物為338F和518R ;
[0026] 步驟巧）中測序反應體系為；Big Dye Seq Buffer (；5X) 2 yL，Big Dye (2. 5 X) 0. 5 y L，測序模板 DNAO. 5 y L，測序引物（10 y M) 0. 5 y L，加 dd&O 至 10 y L，測序 反應所用的引物為338F和518R。
[0027] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[002引 1)本發(fā)明W醬油曲酷為目標物，建立了擴增16S rDNA V3可變區(qū)的PCR反應體系 和反應程序，確定了變性梯度凝膠電泳的反應條件，最終建立并優(yōu)化了醬油曲酷中未知微 生物群落的檢測體系。
[0029] 2)本發(fā)明適用于醬油曲酷中未知微生物群落分析，成本低廉、具可重復性、可直接 快速分析的優(yōu)點，無需分離培養(yǎng)的過程，便可獲得微生物群落完整的相關信息。
[0030] 3)本發(fā)明w微生物的DM序列為對象的分子生物技術，可w大規(guī)模地平行處理多 種微生物的種群動態(tài)變化規(guī)律，該是傳統(tǒng)研究技術無法比擬的；醬油制曲和發(fā)酵過程中微 生物群落結構和動力學變化規(guī)律可W成為傳統(tǒng)釀造業(yè)改造的突破口，使我們不僅可W深入 研究純種微生物的發(fā)酵生產工藝，而且能夠深入研究傳統(tǒng)釀造中的群體微生物在發(fā)酵生產 過程的作用。通過該些研究，分析出影響發(fā)酵制品的質量問題和安全問題。
【附圖說明】
[003U 圖1為16S rDNA目標片段PCR擴增電泳圖；
[003引圖2為不同發(fā)酵時間樣品細菌總DNA的DGGE圖譜；
[0033] 圖3為不同發(fā)酵時期微生物種群多樣性聚類分析圖。
【具體實施方式】
[0034] 為更好地理解本發(fā)明，下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但實施 例不構成對本發(fā)明保護范圍的限定。
[00對實施例
[0036] 一種分析醬油曲酷中未知微生物的方法，包括如下步驟；
[0037] 1、取樣品；
[003引由于傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)釀造工藝的醬油生產的發(fā)酵周期為3個月，因此，共7個采樣時 間，分別為；發(fā)酵0天、15天、30天、45天、60天、75天及90天。采樣位置為發(fā)酵罐的中層 曲膠和頂層曲膠。
[0039] 2、總 DNA 提取
[0040] 無菌條件下分別取不同時間采集的樣品lOg，加入50mL滅菌雙蒸水，搖床振蕩 60min。4°C，4000g離屯、15min，取上清于4°C，5000g離屯、lOmin，取上清液，于4°C保存。參 照醬油類DNA提取試劑盒（購自北京鼎國生物技術有限責任公司）說明提取預處理過的樣 品，所提取的DNA溶于TE緩沖液，-20°C條件下保存。
[00川 3、PCR - DGGE引物序列
[0042] 引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：
[0043] SEQ. ID. N01 ;引物 338F - GC - clamp ;
[0044] SEQ. ID. N02 ;引物 518R;
[0045] 沈Q. ID. N03 ;引物 338F。
[0046] PCR 引物 338F - GC - clamp(SEQ. ID. NOl)和引物 518R(SEQ. ID. N02)是用來擴增 16S rDNA V3 可變區(qū)，引物 338F(SEQ. ID. N03)和引物 518R(SEQ. ID. N02)是用來擴增 DGGE 電泳后切膠回收的產物，同時也作為測序反應的引物。
[0047] 4、16S rDNA V3 片段的擴增
[0048] 50 y 1 的 PCR 反應體系女日下；25 y 1 的 Premix Taq(TaKaRa 公司），模板 DNA 5 y 1， 338F - GC - clamp(SEQ. ID.N01)和引物518R(SEQ. ID. NO。分別作為正、反引物，正反引物 (20yM)各lyl，適量的滅菌雙蒸水補足50yl。
[0049] PCR反應程序；PCR反應采用touchd