用于調(diào)節(jié)mecp2表達的組合物和方法
【專利說明】用于調(diào)節(jié)MECP2表達的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求2012年5月16日提交的名稱為"用于調(diào) 節(jié) MECP2 表達的組合物和方法（COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING MECP2 EXPRESSION)"的美國臨時申請?zhí)?1/648,051的權(quán)益，將其通過引用以其全文結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及基于寡核苷酸的組合物，以及使用基于寡核苷酸的組合物用于治療疾 病的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 瑞特（Rett)綜合征是主要發(fā)生在女性中的大腦的發(fā)育障礙，其特征在于正常的 早期發(fā)育，隨后是發(fā)育遲緩，導(dǎo)致手失控、語言喪失、呼吸問題、大腦和頭部生長遲緩、步行 問題、癲癇、以及智力遲鈍。瑞特綜合征影響大約10, 〇〇〇之一的活著的女性出生人數(shù)。瑞 特綜合征的大多數(shù)情況是由位于X染色體上的甲基CpG結(jié)合蛋白2、或MECP2基因中的突變 引起的，該突變導(dǎo)致MECP2的活性降低或失活。
[0006] MECP2是轉(zhuǎn)錄阻抑物，其結(jié)合甲基化的DNA并且在成熟神經(jīng)細胞中大量存在。 MECP2通過與組蛋白脫乙酰酶和輔阻遏物SIN3A的相互作用阻抑從甲基化的基因啟動子的 轉(zhuǎn)錄。已知被MECP2蛋白調(diào)節(jié)的基因中的許多在正常大腦功能中發(fā)揮作用，特別是維持突 觸。小鼠研究已經(jīng)證明MECP2突變導(dǎo)致突觸功能的缺陷，特別是突觸可塑性中的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在此披露的本發(fā)明的方面提供可用于上調(diào)細胞內(nèi)MECP2的方法和組合物。在一些 實施例中，提供單鏈寡核苷酸，其靶向MECP2基因（例如，人MECP2)的PRC2相關(guān)區(qū)并且因 此引起該基因的上調(diào)。在一些實施例中，提供單鏈寡核苷酸，這些單鏈寡核苷酸靶向編碼 MECP2的基因的PRC2相關(guān)區(qū)。在一些實施例中，這些單鏈寡核苷酸通過緩解或阻止PRC2介 導(dǎo)的對MECP2的阻抑來激活或增強MECP2的表達。
[0008] MECP2的上調(diào)提供了針對與降低的MECP2活性相關(guān)的疾病的治療。在此披露的 本發(fā)明的多個方面提供有用于上調(diào)MECP2以治療和/或預(yù)防瑞特綜合征的方法和組合物。 MECP2也與MECP2相關(guān)的嚴重新生兒腦病、安格爾曼綜合征、以及PPM-X綜合征相關(guān)。因此， 此處披露的本發(fā)明的某些方面提供了有用于上調(diào)MECP2以治療和/或預(yù)防MECP2相關(guān)的嚴 重新生兒腦病、安格爾曼綜合征、以及PPM-X綜合征的方法和組合物。
[0009] 本發(fā)明的另外的方面提供用于選擇用于激活或增強MECP2的表達的寡核苷酸的 方法。在一些實施例中，提供用于選擇一組寡核苷酸的方法，該組寡核苷酸中富集于用于激 活或增強MECP2的表達的候選物（例如，與寡核苷酸隨機選擇相比較）中。因此，這些方法 可以用于建立其中富集了激活或增強MECP2的表達的寡核苷酸的多組臨床候選物。這類庫 可以被利用來例如鑒別用于開發(fā)治療MECP2的治療劑的先導(dǎo)寡核苷酸。另外，在一些實施 例中，提供寡核苷酸化學性質(zhì)，其可用于控制用于激活MECP2的表達的單鏈寡核苷酸的藥 物代謝動力學、生物分布、生物可利用性和/或功效。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供單鏈寡核苷酸，這些單鏈寡核苷酸具有與MECP2基 因的PRC2相關(guān)區(qū)（例如，該區(qū)的至少8個連續(xù)核苷酸）（例如，如SEQ ID NO :1或2中給 出的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)）互補的區(qū)。在一些實施例中，寡核苷酸具有以下特征中的 至少一個：a)為5' X-Y-Z的序列，其中X為任何核苷酸并且其中X位于寡核苷酸的5'端， Y為非為微小RNA的人種子序列的、長度為6個核苷酸的核苷酸序列，并且Z為長度為1至 23個核苷酸的核苷酸序列；b)不包括三個或更多個連續(xù)鳥苷核苷酸的序列；c)與每個核苷 酸序列具有閾值水平以下的序列一致性的序列，這些核苷酸長度等于第二核苷酸序列、在 脫靶基因的5'端上游的50千堿基與該脫靶基因的3'端下游的50千堿基之間；d)與編碼 RNA的PRC2相關(guān)區(qū)互補的序列，該RNA形成包括至少兩個單鏈環(huán)的二級結(jié)構(gòu)；以及e)具有 60%以上G-C含量的序列。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸具有各自獨立地選擇的特征 a)、b)、c)、d)以及e)中的至少兩種。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸具有各自獨立地選 擇的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三種。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸具有各 自獨立地選擇的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四種。在一些實施例中，該單鏈寡核 苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一種。在某些實施例中，該寡核苷酸具有序列 5' X-Y-Z，其中該寡核苷酸的長度為8至50個核苷酸。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供具有序列X-Y-Z的單鏈寡核苷酸，其中X為任何核苷 酸，Y為非為人微小RNA的種子序列的、長度為6個核苷酸的核苷酸序列，并且Z為長度為1 至23個核苷酸的核苷酸序列，其中該單鏈寡核苷酸與MECP2基因的PRC2相關(guān)區(qū)（例如，如 SEQ ID NO :1或2中給出的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)）互補。在本發(fā)明的一些方面中，提 供具有序列5' -X-Y-Z的單鏈寡核苷酸，其中X為任何核苷酸，Y為非為人微小RNA的種子 序列的、長度為6個核苷酸的核苷酸序列，并且Z為長度為1至23個核苷酸的核苷酸序列， 其中該單鏈寡核苷酸與MECP2基因的PRC2相關(guān)區(qū)（例如，如SEQ ID NO :1或2中給出的核 苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)）的至少8個連續(xù)核苷酸互補。在一些實施例中，Y為選自表1的 序列。在一些實施例中，該PRC2相關(guān)區(qū)為SEQ ID NO :5至118中任一個中列出的序列。
[0012] 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO : 119至83660中任一個中給 出的核苷酸序列，或其至少8個核苷酸的片段。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如 SEQ ID NO :119至83660中任一個中給出的核苷酸序列，其中所提供的核苷酸序列的5'端 是該寡核苷酸的5'端。在一些實施例中，該互補區(qū)（例如，至少8個連續(xù)核苷酸）還存在 于如SEQ ID NO :3或4中給出的核苷酸序列中。
[0013] 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO : 119至83660中任一個中給 出的核苷酸序列。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO : 119至83660中任 一個中給出的核苷酸序列中至少8個核苷酸的片段。
[0014] 在一些實施例中，該PRC2相關(guān)區(qū)為SEQ ID NO :5至84中任一個中列出的序列。 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :119至47653中任一個中給出的核苷 酸序列，或其至少8個核苷酸的片段。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 119至47653中任一個中給出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO :119至47653中任一項中 提供的核苷酸序列的5'端是該寡核苷酸的5'端。在一些實施例中，該至少8個連續(xù)核苷 酸還存在于如SEQ ID NO :3中給出的核苷酸序列中。
[0015] 在一些實施例中，該PRC2相關(guān)區(qū)為SEQ ID NO :85至118中任一個中列出的序列。 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :47462至83660中任一個中給出的核 苷酸序列，或其至少8個核苷酸的片段。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :47462至83660中任一個中給出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO :47462至83660中任 一項中提供的核苷酸序列的5'端是該寡核苷酸的5'端。在一些實施例中，該至少8個連 續(xù)核苷酸存在于如SEQ ID NO :4中給出的核苷酸序列中。
[0016] 在一些實施例中，單鏈寡核苷酸包括如表3中給出的核苷酸序列。在一些實施例 中，該單鏈寡核苷酸包括如表3中給出的核苷酸序列中至少8個核苷酸的片段。在一些實 施例中，單鏈寡核苷酸由如表3中給出的核苷酸序列組成。
[0017] 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸不包括三個或更多個連續(xù)鳥苷核苷酸。在一些 實施例中，該單鏈寡核苷酸不包括四個或更多個連續(xù)鳥苷核苷酸。
[0018] 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸的長度為8至30個核苷酸。在一些實施例中， 該單鏈寡核苷酸的長度高達50個核苷酸。在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸的長度為8至 10個核苷酸，并且該PRC2相關(guān)區(qū)的互補序列中除1、2或3個核苷酸之外的所有都為胞嘧啶 或鳥苷核苷酸。
[0019] 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸與MECP2基因的PRC2相關(guān)區(qū)、例如SEQ ID NO : 1或2中給出的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)的至少8個連續(xù)核苷酸互補，其中該單鏈寡核苷 酸的核苷酸序列包括選自下組的核苷酸序列中的一個或多個，該組由以下各項組成
[0020] (a) (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx and (X) xxxxxX,
[0021] (b) (X) XXxxxx, (X) XxXxxx, (X) XxxXxx, (X) XxxxXx, (X) XxxxxX, (X)xXXxxx, (X) xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX 和（X)xxxxXX,
[0022] (c) (X) XXXxxx，（X) xXXXxx，（X) xxXXXx, (X) xxxXXX，（X) XXxXxx，（X) XXxxXx，（X) XXxxxX，（X)xXXxXx，（X)xXXxxX，（X)xxXXxX，（X)XxXXxx，（X) XxxXXx(X)XxxxXX，（X)xXxXXx， (X)xXxxXX， （X)xxXxXX， （X)xXxXxX 和（X)XxXxXx，
[0023] (d)(X)xxXXX， （X)xXxXXX， （X)xXXxXX， （X)xXXXxX， （X)xXXXXx， （X)XxxXXXX， （X) XxXxXX， （X)XxXXxX， （X)XxXXx， （X)XXxxXX， （X)XXxXxX， （X)XXxXXx， （X)XXXxxX， （X)XXXxXx， 和⑴ XXXXxx，
[0024] (e) (X) xXXXXX，（X) XxXXXX，（X) XXxXXX，（X) XXXxXX，（X) XXXXxX 和（X) XXXXXx，以及
[0025] (f) XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX 以及 XXXXXXx，其中 " X " 表示核苷酸類似物，（X)表示任選的核苷酸類似物，并且"x"表示DNA或RNA核苷酸單位。
[0026] 在一些實施例中，該寡核苷酸的至少一個核苷酸為核苷酸類似物。在一些實施例 中，與不具有至少一個核苷酸類似物的寡核苷酸相比較，該至少一個核苷酸類似物導(dǎo)致該 寡核苷酸的的Tm在1°C至5°C的范圍內(nèi)的升高。
[0027] 在一些實施例中，該寡核苷酸的至少一個核苷酸包括2' 0-甲基。在一些實施例 中，該寡核苷酸的每個核苷酸包括2' 0-甲基。在一些實施例中，該寡核苷酸包括至少一個 核糖核苷酸、至少一個脫氧核糖核苷酸或至少一個橋連核苷酸。在一些實施例中，該橋連核 苷酸為LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修飾的核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸的每個 核苷酸為LNA核苷酸。
[0028] 在一些實施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核糖核苷酸以及 2' -氟-脫氧核糖核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核糖核 苷酸以及2' -0-甲基核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核糖 核苷酸以及ENA核苷酸類似物。在一些實施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核 糖核苷酸以及LNA核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸的5'核苷酸為脫氧核糖核苷酸。 在一些實施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的LNA核苷酸和2' -0-甲基核苷酸。在一 些實施例中，該寡核苷酸的5'核苷酸為LNA核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸的核苷 酸包括通過脫氧核糖核苷酸的5'端和3'端中的每一個上的至少一個LNA核苷酸側(cè)接的脫 氧核糖核苷酸。
[0029] 在一些實施例中，該單鏈寡核苷酸包括至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個 或更多個核苷酸之間的修飾的核苷酸間鍵（例如，硫代磷酸酯核苷酸間鍵或其他鍵）。在一 些實施