舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在無公害防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種亞洲型舞毒蛾的細(xì)胞色素 P450基因 CYP6AN15vldsRNA及其在防治亞洲型舞毒蛾中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)國外報道舞毒蛾Linnaeus)可危害300多種植物，國內(nèi)報 道可危害楊、柳、蘋果、樟子松、落葉松等500余種植物。舞毒蛾傳播快，繁殖量和取食量大， 給林業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失。目前對亞洲型舞毒蛾的防治，仍然是以化學(xué)殺蟲劑為主， 雖然防效顯著，但這些化合物容易引起"3R"問題不容忽視。盡管一些害蟲天敵、致病微生 物等生物防治手段在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但這些防治技術(shù)存在受外界環(huán)境影響 大、見效慢、效果不明顯等弊病，嚴(yán)重制約了舞毒蛾防治的發(fā)展。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展， 利用RNAi技術(shù)控制害蟲的危害已成為植物保護工作者研宄的重點和熱點。RNAi技術(shù)因具 有高效、特異性等特點，在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域展示出了很大的潛力，并且作為一種新的方法 來防治農(nóng)林業(yè)害蟲。迄今，RNAi技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)害蟲防治中得到應(yīng)用。一方面是通過導(dǎo)入 功能基因 dsRNA來實現(xiàn)RNAi，當(dāng)有害生物取食轉(zhuǎn)基因植物時，引發(fā)害蟲體內(nèi)發(fā)生基因沉默 失去功能，降低害蟲的取食能力；例如，張維等（2013)將棉蚜的V-ATPase-A基因轉(zhuǎn)入到擬 南芥中并飼喂煙草天蛾幼蟲具有致死效應(yīng)；李曉明等（2010)通過轉(zhuǎn)基因煙草對棉蚜有一 定的防控效果；Mao等（2007)研宄發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲取食含有表達CYP6AE14的dsRNA轉(zhuǎn)基因棉 花后，棉鈴蟲的P450基因表達量明顯降低，害蟲的食欲降低，生長發(fā)育遲緩，最后死亡。另 一方面，通過篩選具有致死效應(yīng)的siRNA(-般來源于生物體內(nèi)參與重要生物化學(xué)途徑的候 選基因)，通過化學(xué)方法合成，可應(yīng)用于新型的殺蟲劑生物農(nóng)藥。鑒于RNAi技術(shù)具有高效性 和特異性，對人畜和非靶標(biāo)生物安全、無害蟲抗藥性等特點，緩解了化學(xué)農(nóng)藥長期施用導(dǎo)致 "3R"這一難題。因此，RNAi技術(shù)將為害蟲防治開辟了新的途徑。在昆蟲中，細(xì)胞色素 P450 的功能主要與抗藥性相關(guān)，主要參與代謝殺蟲劑或來自植物的次生物質(zhì)，其對殺蟲劑的代 謝是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的重要機制之一。
[0003] 目前，有關(guān)通過抑制細(xì)胞色素 P450 CYP6AN15V1基因轉(zhuǎn)錄水平來防治林木重要害 蟲舞毒蛾及提高其對有機磷類農(nóng)藥氧化樂果的敏感性未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種舞毒蛾CYP6AN15V1基因 dsRNA及其在無公害防治中 的應(yīng)用，利用分子生物學(xué)手段干擾舞毒蛾重要的解毒酶基因 CYP6AN15vl，降低了昆蟲的 生存能力，甚至死亡，同時還提高了對有機磷類殺蟲劑的敏感性。舞毒蛾細(xì)胞色素 P450 CYP6AN15vl基因沉默后，顯著影響舞毒蛾幼蟲的生長發(fā)育和生理代謝，同時有機磷類殺蟲 劑的敏感性提高，對防治無公害舞毒蛾提供了新思路和新材料。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，如無特殊說明，本發(fā)明所采用 的技術(shù)方法，均為本領(lǐng)域中常用的方法。
[0006] 一種亞洲型舞毒蛾細(xì)胞色素 P450 CYP6AN15vl基因，其核酸序列如SEQ ID No. I 所示，編碼氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，獲得方法如下： 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索舞毒蛾CYP6AN15vl (登陸號為KF853201. 1)的細(xì)胞色素 P450 序列，設(shè)計編碼區(qū)設(shè)計上游引物 Ld CYP6AN15vlF:5' ATGTTCGCTCTATTACTACTGTTTCTACTACT ATTAG 3' ； Ld CYP6AN15vlR: 5' TTTCCTCAGCTTCAGTCTAACAGGTAGACC3'，通過 RT-PCR 法擴 增獲得如SEQ ID NO. 1所示序列。
[0007] 本發(fā)明以亞洲型舞毒蛾CYP6AN15V1基因片段為模板，并設(shè)計特異的dsRNA引物 對，通過 MEGAscript RNAi 試劑盒（Ambion)合成 CYP6AN15vl 基因 dsRNA，dsRNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0008] 上述CYP6AN15vl基因 dsRNA在無公害防治中的應(yīng)用，主要表現(xiàn)在以下兩方面： 一、在調(diào)控舞毒蛾生長發(fā)育中的應(yīng)用。微量注射dsRNA到昆蟲幼蟲體腔，觀測其營養(yǎng)利 用指標(biāo)、幼蟲鮮重。結(jié)果表明：CYP6AN15vl基因沉默舞毒蛾幼蟲8 d內(nèi)體重增加量小于對照 ddH20,但高于GFP，且1~6 d體重增加量小于GFP dsRNA和CldH2O處理組，對舞毒蛾營養(yǎng)利 用指標(biāo)也有顯著的影響，導(dǎo)致食物轉(zhuǎn)化率和食物利用率顯著小于對照（/^〈 0.05); dsRNA 可以在特定時間內(nèi)高效特異的沉默舞毒蛾體內(nèi)CYP6AN15vl基因的mRNA表達。
[0009] 二、在提高舞毒蛾幼蟲對有機磷類殺蟲劑氧化樂果的敏感性中的應(yīng)用。結(jié)果表明： 舞毒蛾幼蟲對有機磷類殺蟲劑的敏感性顯著提高。
[0010] 本發(fā)明具有如下有益效果： 1、本發(fā)明公開了亞洲型舞毒蛾細(xì)胞色素基因 CYP6AN15V1全長核酸序列以及應(yīng)用于合 成dsRNA的序列；根據(jù)本發(fā)明提供的基因全長及用于合成dsRNA的序列可顯著抑制其表達， 影響舞毒蛾生長發(fā)育并提高其對有機磷類殺蟲劑的敏感性，這方面的研宄未見相關(guān)報道。
[0011] 2、本發(fā)明提供可利用CYP6AN15V1的dsRNA干擾方法可提高舞毒蛾對有機磷類殺 蟲劑的敏感性，從而應(yīng)用于對舞毒蛾的防治，同時解決"3R"問題及殺蟲劑抗性等問題，為綠 色環(huán)境友好型防治林業(yè)害蟲提供了一個新的思路和實踐技術(shù)。
[0012] 3、將dsRNA注入舞毒蛾3齡幼蟲體腔內(nèi)，結(jié)果表明，與對照(注射CldH2O和GFP dsRNA)相比，高效沉默了舞毒蛾的靶標(biāo)基因 CYP6AN15vl，致使舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育緩慢，顯 著影響其正常的生理代謝，累計死亡率達40%，同時顯著提高了對有機磷類殺蟲劑氧化樂果 的敏感性。
【附圖說明】
[0013] 圖1為注射dsRNA舞毒蛾3齡幼蟲癥狀； 圖2為注射dsRNA舞毒蛾3齡幼蟲CYP6AN15vl基因表達水平； 圖3為舞毒蛾CYP6AN15vl基因電泳圖； 圖4為舞毒蛾CYP6AN15vldsRNA基因片段電泳圖； 圖5為舞毒蛾CYP6AN15vl基因沉默對幼蟲鮮重的影響； 圖6為舞毒蛾CYP6AN15vl基因沉默的舞毒蛾幼蟲對氧化樂果的敏感性。
【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0015] 實施例1:舞毒蛾細(xì)胞色素 CYP6 AN15vl基因全長克隆 舞毒蛾細(xì)胞色素 CYP6 AN15vl基因核酸序列2224 bp(SEQ ID No. 1)，開放閱讀框1536 bp，編碼512個氨基酸(序列如SEQ ID No. 2所示)，分子量大小為59. 02 kDa，理論等電點 PI為9. 03,為一堿性蛋白。
[0016] 提取舞毒蛾總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa) 合成cDNA第一條鏈，再以cDNA第一鏈為模板，根據(jù)舞毒蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組序列在基因編碼區(qū)序 列的兩側(cè)設(shè)計引物（正向引物：5' - ATGTTCGCTCTATTACTACTGTTTCTACTACTATTAG -3' ；反向 引物：5' - TTTCCTCAGCTTCAGTCTAACAGGTAGACC -3'）。反應(yīng)體系：5XPrimeScript buffer 2 μ L、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0. 5 μL、Oligo d(T) primer (50 μ M) 0. 5 μL、 Random 6 mers (100 μ M) 0.5 μ L、Total RNA 0.5 yg RNase Free ddH20 補足 10 yL〇 PCR擴增程序如下：94°C 3 min;94°C 30 s，60°C 30s，72°C 2 min，35 個循環(huán)；72°C 延伸 10 min。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收1536 bp的條帶， 見圖3。將回收得到的條帶與pMD18-T載體連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。 通過菌液PCR檢測的陽性克隆菌液，送至北京華大生物技術(shù)有限公司測序以驗證讀碼框。
[0017] 實施例2:舞毒蛾CYP6 AN15vl基因 dsRNA的合成 根據(jù)實施例1中所克隆的舞毒蛾CYP6AN15vl基因全長，設(shè)計合成CYP6AN15vl基因 dsRNA 正向引物 Ld CYP6AN15vlF: (5, - ATGTTCGCTCTATTACTACTGTTTCTACTACTATTAG -3，） 和反向引物 Ld CYP6AN15vlR: (5'_ TTTCCTCAGCTTCAGTCTAACAGGTAGACC -3'），擴增得到片 段長度為599 bp的序列，通過體外dsRNA合成試劑盒獲得CYP6 AN15vl基因的dsRNA。
[0018] 具體地合成過程是，在每條特異性引物的5'端加有一段20 bp左右的T7啟動子 序列，用GFP作為對照組。通過PCR法擴增目的條帶，反應(yīng)程序為：94°C 3 min ;94°C 30 s，60°C 30 s，72°C I min, 35個循環(huán)；72°C 7 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測確認(rèn)后作為模 板合成dsRNA (參照MEGAscript RNAi Kit試劑盒說明書)，于紫外分光光度計檢測dsRNA 濃度，并取〇. 5PL dsRNA于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認(rèn)，-80°C保存?zhèn)溆茫妶D4。
[0019] 實施例3:舞毒蛾CYP6AN15vl基因沉默效果的檢測 將實施例2合成的CYP6AN15vl基因和GFP基因的dsRNA (1 μ g)，微注射入舞毒蛾3 齡幼蟲，分別于6h、ld、4d和6d選取活潑的3齡幼蟲，采用RNeasy Mini動物組織總RNA提 取試劑盒（Qiagen)提取總RNA，采用PrimeScript?RT試劑盒（TaKaRa)合成cDNA第一條 鏈，以此為模板，運用熒光定量RT-PCR檢測注射后CYP6AN15vl基因的表達量，以注射外源 基因 GFP dsRNA為對照。研宄結(jié)果表明注射6 h時，CYP6AN15vldsRNA處理組的CYP6AN15vl 相對表達量明顯應(yīng)激誘導(dǎo)上調(diào)，為CldH2O對照組的13. 45倍，為GFP dsRNA對照組的4. 16 倍；隨著作用時間的增加，處理Id時，CYP6AN15vldsRNA處理組的CYP6AN15vl相對表達量 被沉默下調(diào)，為CldH 2O對照組的0. 86倍；持續(xù)沉默4d時，CYP6AN15vl dsRNA處理組該基因 的相對表達量為CldH2O對照組的0. 11倍，然而處理6d CYP6AN15vl表達量上調(diào)（內(nèi)參基因 為ActiruEFl a、TUB，引物見表1)，可能沉默效果消失。
[0020] 表I RNAi干擾中的相關(guān)引物
【主權(quán)項】
1. 舞毒蛾CYP6AN15vl基因 dsRNA，其特征在于所述dsRNA序列如SEQ ID NO. 3所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述舞毒蛾CYP6AN15vl基因 dsRNA在調(diào)控舞毒蛾生長發(fā)育或提高 舞毒蛾對有機磷類殺蟲劑敏感性中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的舞毒蛾CYP6AN15vl基因 dsRNA在抑制舞毒蛾生長發(fā)育或提 高舞毒蛾對有機磷類殺蟲劑敏感性中的應(yīng)用，其特征在于所述舞毒蛾為亞洲型舞毒蛾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的舞毒蛾CYP6AN15vl基因 dsRNA在抑制舞毒蛾生長發(fā)育或提 高舞毒蛾對有機磷類殺蟲劑敏感性中的應(yīng)用，其特征在于所述CYP6AN15vl基因 dsRNA的注 射劑量為I yg。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在無公害防治中的應(yīng)用。所述dsRNA序列如SEQ ID NO.3所示，其可應(yīng)用在調(diào)控舞毒蛾生長發(fā)育或提高舞毒蛾對有機磷類殺蟲劑敏感性中。實驗結(jié)果表明：CYP6AN15v1基因沉默舞毒蛾幼蟲8d內(nèi)體重增加量小于對照ddH2O，但高于GFP，且1~6d體重增加量小于GFPdsRNA和ddH2O處理組，對舞毒蛾營養(yǎng)利用指標(biāo)也有顯著的影響，導(dǎo)致食物轉(zhuǎn)化率和食物利用率顯著小于對照（P < 0.05）；dsRNA可以在特定時間內(nèi)高效特異的沉默舞毒蛾體內(nèi)CYP6AN15v1基因的mRNA表達；而且舞毒蛾幼蟲對有機磷類殺蟲劑的敏感性顯著提高。
【IPC分類】A01P7-04, A01N57-16, C12N15-113, C12N15-89
【公開號】CN104561006
【申請?zhí)枴緾N201510054278
【發(fā)明人】曹傳旺, 高彩球, 孫麗麗, 王超, 張健, 吳韶平
【申請人】東北林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年2月3日