產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及產氣莢膜梭菌ε毒素，尤其涉及產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體，本 發(fā)明進一步涉及所述產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體在制備ε毒素亞單位疫苗或多價梭 菌毒素亞單位疫苗中的應用，屬于產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體及其應用領域。
【背景技術】
[0002] 產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)是芽孢桿菌科梭菌屬的成員，該菌可 產生至少16種外毒素，并通過其產生的毒素發(fā)揮致病作用，可引起多種動物發(fā)生腸毒血癥 和/或壞死性腸炎、人畜創(chuàng)傷性氣壞疽以及人類食物中毒。根據(jù)產生4種主要致死性外毒 素 α、β、ε、t的種類，將該菌分為A、B、C、D、E五個毒素型。
[0003] 產氣莢膜梭菌病具有發(fā)病急、病程短且死亡率極高的特點，一旦發(fā)病，往往還來不 及治療就因外毒素中毒而發(fā)生猝死，因此免疫接種（而不是治療）是防控該病的有效方法。 目前使用的商品化疫苗主要為滅活疫苗，其在制備過程中涉及到外毒素的滅活，存在毒素 外泄或滅活不徹底的安全隱患；此外，培養(yǎng)上清中的各種微小毒素以及細菌的代謝產物往 往成為免疫動物的致敏原，接種動物易產生副作用，而且導致免疫效果下降甚至免疫失敗。 因此，近些年來研宄者致力于梭菌毒素基因工程減毒疫苗的開發(fā)，結果顯示，針對主要毒素 抗原片段的亞單位疫苗具有安全性好、有效抗原含量高、免疫原性強等優(yōu)點，具有誘人的開 發(fā)前景。
[0004] ε毒素由B型和D型產氣莢膜梭菌產生，其以前毒素的形式分泌于菌體外，全長 296個氨基酸。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的λ蛋白酶作用后，去除 N端11-13個以及C端22-29個氨基酸，從而活化為成熟毒素。ε毒素屬于β穿孔素家族 的成員，是產氣莢膜梭菌毒素中毒力最強的毒素，其毒力僅次于肉毒桿菌素和破傷風神經(jīng) 毒素的毒力而成為第三強的梭菌類毒素。因此，實現(xiàn)ε毒素的減毒以及構建相關減毒體， 對于開發(fā)ε毒素基因工程減毒亞單位疫苗以及其作為抗原組分的多價亞單位疫苗的研宄 和應用就顯得尤為重要。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens) ε毒素減毒突變體，其在體外細胞水平以及體內水平均實現(xiàn)完全減毒且對動 物呈現(xiàn)良好的免疫原性和免疫保護性。
[0006] 本發(fā)明所要解決的上述技術問題是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明首先公開了產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens) ε毒素減毒突變 體，該突變體通過將野生型ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突變?yōu)榉欠枷阕灏被岖@得； 其中，所述的非芳香族氨基酸是除酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸之外的氨基酸，優(yōu)選為丙氨 酸、谷氨酸、蘇氨酸或甘氨酸中的任意一種；最優(yōu)選為丙氨酸。
[0008] 本發(fā)明野生型ε毒素成熟毒素基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示，野生型ε 毒素成熟毒素的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示；野生型ε前毒素基因的核苷酸序列為 SEQ ID No. 3所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID No. 4所示。
[0009] 本發(fā)明進一步提供了編碼所述產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體的基因，優(yōu)選的， 其核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示。
[0010] 本發(fā)明進一步公開了含有所述產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體的編碼基因的 重組表達載體。將本發(fā)明的產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體的編碼基因插入到表達載 體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作 為一個方案的例證，所述重組表達載體可以為pET-22b-Etx-Y71Α、pET-22b-Etx-Y7 IE、 pET-22b-Etx-Y71G 或 pET-22b-Etx-Y71S。
[0011] 本發(fā)明還公開了含有所述重組表達載體的重組宿主細胞；所述重組宿主細胞可為 原核細胞或真核細胞。
[0012] 本發(fā)明在ε毒素三維結構模型分析的基礎上，選擇ε毒素 Domain III區(qū)的芳香族 氨基酸Y71、F92、Y169和Y254作為突變位點，根據(jù)已發(fā)表的ε毒素基因序列，針對ε前毒 素基因 Etx設計表達引物，同時設計突變引物用于Y71A、F92A、Y169A與Υ254Α突變位點的 引入，分別將這些氨基酸突變?yōu)闊o特殊側鏈結構的惰性氨基酸丙氨酸（A);并且設計突變 引物用于Y71E、Y71G、Y71S、Y71F和Y71W突變位點的引入，將Y71分別用谷氨酸（E)、蘇氨 酸（S)、甘氨酸（G)、色氨酸（W)以及苯丙氨酸（F)這5個具有不同側鏈結構的氨基酸進行替 換。本發(fā)明以產氣莢膜梭菌D型參考株CVCC C60-1的基因組DNA為模板，對Etx基因進行 擴增，同時通過融合PCR擴增Etx突變體基因 Etx-Y71A、Etx-F92A、Etx-Y169A、Etx-Y254A、 Etx-Y71E、Etx-Y71G、Etx-Y71S、Etx-Y71F 和 Etx-Y71W。
[0013] 本發(fā)明將擴增的野生型Etx基因及其突變體的基因片段克隆入原核表達載體 pET-22b (+)中構建重組質粒，轉化大腸桿菌，誘導重組毒素的表達。
[0014] 經(jīng)鑒定，所有構建的重組毒素包括野生型ε前毒素 rEtx及其突變體rEtx_Y71A、 rEtx-F92A、rEtx-Y169A 與 rEtx-Y254A 以及 Y71 的 5 個突變體 rEtx-Y71E、rEtx-Y71S、 吐七1-￥716、吐七1-￥711、吐七1-￥7]^均在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達，大小約351^^。表達的 重組野生型毒素及其突變體均為前毒素形式，通過胰酶的活化，各種重組前毒素均被成功 活化為大小約為30kDa的成熟毒素，可用于功能性驗證。胰酶的成功活化表明，本發(fā)明表達 的重組毒素的空間結構沒有發(fā)生明顯的改變。
[0015] 本發(fā)明將活化的重組野生型毒素（rEtx)及其突變體作用MDCK細胞后，檢測其對 細胞毒性。結果表明，野生型毒素在〇. 1 μ g/mL時即可完全殺死細胞，與預期相符；在毒素 突變體中，rEtx-Y169A、rEtx-Y254A與rEtx對MDCK細胞的毒性相似，rEtx-F92A與rEtx相 比，在0. 01 μ g/mL時的毒力弱于rEtx，但當濃度達到0. 1 μ g/mL即可100%致死細胞；而突 變體rEtx-Y71A即使在10 μ g/mL時對細胞仍然沒有毒性，顯示該突變體在細胞水平上成功 減毒，這表明位于Domain III中的Y71是ε毒素發(fā)揮其細胞毒性的關鍵氨基酸。本發(fā)明將 活化的 Υ71 突變體 rEtx-Y71E、rEtx-Y71S、rEtx-Y71G、rEtx-Y71W 以及 rEtx-Y71F 分別作用 于MDCK細胞檢測其細胞毒性，以確定不同氨基酸側鏈結構對Y71功能的影響。結果表明， 當Y71突變?yōu)榉欠枷阕灏被酔、G、S時，突變體在10 μ g/mL時對細胞仍然沒有毒性，表明 這些突變體在細胞水平上成功減毒；只有當Y71突變?yōu)榉枷阕灏被醀或F時，突變體才具 有細胞毒性，而且突變體rEtx-Y71W在0. 1 μ g/mL時即可完全殺死細胞，顯示出與rEtx相 似的細胞毒性，強于突變體rEtx-Y71F的細胞毒性；該實驗結果表明，Y71位點的芳香環(huán)側 鏈結構是ε毒素發(fā)揮其細胞毒性所必需的。
[0016] 本發(fā)明采用細胞鈣離子流動試驗檢測活化的重組毒素作用細胞后鈣離子濃度的 變化，以確定毒素對細胞的穿孔效應。結果表明，rEtx-F92A，rEtx-Y169A與rEtx-Y254A作 用細胞后，細胞內的鈣離子濃度明顯增加，其中rEtx-Y169A與rEtx-Y254A導致鈣離子升高 的程度與速度與rEtx相似，高于rEtx-F92A，表明這三個突變體均能夠導致細胞穿孔效應， 其中Y169與Y254兩個位點的突變對毒素的穿孔效應沒有影響；F92的突變則對毒素的穿 孔效應有所降低；而rEtx-Y71A作用細胞后，細胞內鈣離子濃度并沒有出現(xiàn)明顯的改變，表 明該位點的突變使毒素喪失了對細胞的穿孔能力。因此，本發(fā)明確定Y71是影響ε毒素發(fā) 揮其細胞穿孔效應的關鍵氨基酸。同樣，對活化的Υ71系列突變體（rEtx-Y71E、rEtx-Y71G、 rEtx-Y71S、rEtx-Y71F與rEtx-Y71W)的細胞穿孔效應檢測結果表明，當rEtx-Y71F與 rEtx-Y7IW作用于MDCK細胞后，細胞內的鈣離子濃度出現(xiàn)了增加，其中rEtx-Y7IW導致鈣離 子增加的幅度與速度與rEtx相似，高于rEtx-Y71F ;而當Y71被非芳香族氨基酸E、G與S 替換時，突變體則不能導致細胞內鈣離子濃度的增加，細胞也就不發(fā)生穿孔。表明，Domain III 71位氨基酸殘基的芳香環(huán)側鏈基團對于ε毒素發(fā)揮其細胞穿孔效應是必需的，這與細 胞毒性試驗的結果相吻合。
[0017] 為進一步確定突變體對毒素與細胞相互作用的影響以及Υ71減毒體的減毒機理， 本發(fā)明采用激光共聚焦試驗對突變體與細胞上的結合能力進行了鑒定；結果表明，無論是 活化的 Domain III芳香族氨基酸突變體（rEtx-Y71A、rEtx_F92A、rEtx_Y169A 與 rEtx_Y254A) 還是 Y71 系列突變體（rEtx-Y71E、rEtx-Y71G、rEtx-Y71S、rEtx-Y71F 與 rEtx-Y71W)均與 rEtx相似，在激光共聚焦顯微鏡觀察下，均能在細胞膜上出現(xiàn)明顯的綠色熒光，顯示這些突 變體均能夠結合在MDCK細胞的細胞膜上，表明ε毒素 Domain III的芳香族氨基酸不是細胞 受體結合位點，因此這些氨基酸的的替換并不影響毒素與MDCK細胞的結合；而Y71突變體 毒力的喪失是由于影響了其與細胞結合后的穿孔作用，這與Domain I中關鍵氨基酸的作 用機理是不同的。
[0018] 本發(fā)明的產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體能夠應用于制備預防產氣莢膜梭菌病 的ε毒素亞單位疫苗或多價梭菌毒素亞單位疫苗。
[0019] 本發(fā)明所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素減毒體的編碼基因能夠應用于制備預防產 氣莢膜梭菌病的ε毒素亞單位疫苗或多價梭菌毒素亞單位疫苗。
[0020] 本發(fā)明還公開了一種ε毒素亞單位疫苗組合物，包括：免疫上有效量的所述產氣 莢膜梭菌ε毒素減毒突變體和藥學上可接受的佐劑；
[0021] 優(yōu)選的，所述ε毒素亞單位疫苗組合物由ε毒素減毒體rEtx_Y71A與油佐劑按 照體積比85 :15組成。
[0022] 小鼠毒力試驗結果表明，減毒突變體rEtx-Y71A成熟毒素不僅在細胞水平上實現(xiàn) 了減毒，而且在小鼠體內也成功實現(xiàn)了減毒。
[0023] 減毒體前毒素在小鼠模型的免疫保護試驗結果表明，減毒突變體rEtx_Y71A前毒 素免疫小鼠后誘導了高水平的特異性IgG抗體，對小鼠呈現(xiàn)良好免疫原性；免疫保護性評 價實驗結果表明，減毒突變體rEtx-Y7IA前毒素的免疫保護性與野生型前毒素 rEtx的免疫 保護性無明顯差異，對小鼠呈現(xiàn)良好的免疫保護性，這間接表明Y71A的突變沒有改變ε毒 素的抗原結構，減毒突變體rEtx-Y71A前毒素能夠應用于制備預防產氣莢膜梭菌病的ε毒 素亞單位疫苗或多價梭菌毒素亞單位疫苗。