一株具有優(yōu)良抗自溶性能的釀酒酵母菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株具有優(yōu)良抗自溶性能的釀酒酵母菌株，屬于分子生物學(xué)和微生物 學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母是最為重要的工業(yè)微生物之一，尤其在啤酒生產(chǎn)領(lǐng)域，被譽(yù)為啤酒生產(chǎn)的靈 魂。然而近年來(lái)，酵母在啤酒生產(chǎn)的過(guò)程中，伴隨著自然老化所發(fā)生的酵母自溶現(xiàn)象嚴(yán)重的 影響了啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性等品質(zhì)，因此改善酵母的自溶性能是啤酒生產(chǎn)領(lǐng)域 一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
[0003] 目前，針對(duì)防止酵母自溶的問(wèn)題的研宄多數(shù)集中于改善啤酒生產(chǎn)工藝，少數(shù)通過(guò) 優(yōu)化菌種來(lái)改善。由于技術(shù)和條件的限制，人們對(duì)酵母自溶機(jī)理的認(rèn)識(shí)并不透徹，使得目前 的這些解決方案往往無(wú)法從根本上解決問(wèn)題。
[0004] 本發(fā)明針對(duì)1，3-β -葡聚糖，通過(guò)過(guò)表達(dá)該物質(zhì)的合成基因 fksl來(lái)增加葡聚糖的 合成量，改變細(xì)胞壁的厚度，從而改善酵母菌的自溶性能。本發(fā)明證明可以通過(guò)改變葡聚糖 的含量來(lái)調(diào)控酵母的自溶，該方法為更好的控制和利用酵母自溶現(xiàn)象提供了新思路，獲得 的菌株在改善啤酒品質(zhì)方面有著很好的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首先提供了一株具有優(yōu)良抗自溶性能的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏編號(hào)為CGMCC No. 9628,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微 生物研宄所。
[0006] TEM切片分析、抗逆性分析、模擬自溶實(shí)驗(yàn)及SEM分析結(jié)果表明，本發(fā)明提供的釀 酒酵母相比野生菌，抗自溶的性能明顯提高，且能耐受50ng/mL米卡芬凈、8%的乙醇、0.4M NaCl和無(wú)菌水中饑餓培養(yǎng)24h。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種增強(qiáng)釀酒酵母抗自溶能力的方法，是 通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼1，3-β -葡聚糖合成酶的基因 fksl來(lái)增加葡聚糖的合成量，從而改變細(xì)胞 壁的厚度，改善酵母菌的自溶性能。
[0008] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種獲得所述釀酒酵母CGMCC No. 9628的 方法，是以釀酒酵母基因組中具有多拷貝數(shù)的ISSrDNA作為同源重組整合位點(diǎn)，將強(qiáng)啟動(dòng) 子 PGK1(SEQ ID NO. 1)、抗性篩選基因 KanMX(SEQ ID NO. 2)以及 fksl(SEQ ID NO. 3)基因 連接整合入酵母的基因組，通過(guò)G418抗性篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法主要包括以下步驟：（1)擴(kuò)增釀酒酵母基 因組中的18SrDNA-上游、18SrDNA-下游、PGKl及fksl，以pUG6質(zhì)粒為模板擴(kuò)增KanMX片 段；（2)將獲得的各個(gè)片段通過(guò)亞克隆的方式分別與PMD-19T載體連接，最終通過(guò)雙酶切獲 得目的片段；（3)采用醋酸里化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將該目的片段導(dǎo)入酵母細(xì)胞，通過(guò)同源重組整 合入酵母基因組中，以G418抗性影印平板的方式篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
[0010] 通過(guò)TEM切片分析、抗逆性分析、模擬自溶實(shí)驗(yàn)及SEM分析，本發(fā)明的釀酒酵母 CGMCC No. 9628的抗自溶的性能明顯優(yōu)于原始菌株，結(jié)果如圖3、4、5、6及表1、2所示。與現(xiàn) 有其他改善酵母自溶現(xiàn)象的方法相比，本發(fā)明建立了 1，3-β -葡聚糖含量和酵母自溶性能 之間的關(guān)系，可從根本上解決酵母自溶的問(wèn)題。本發(fā)明提供的釀酒酵母將能更好地用于啤 酒釀造及相關(guān)食品行業(yè)。
[0011] 生物材料保藏
[0012] 一株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9628,保藏地址為北京市朝 陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為構(gòu)建fksl基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的全過(guò)程。
[0014] 圖2為采用不同引物對(duì)重組菌基因組PCR的電泳結(jié)果；A :泳道M為maker2000,泳 道1為過(guò)表達(dá)重組菌，泳道2為野生菌，泳道3為空白對(duì)照；B :泳道M為maker2000,泳道1 為過(guò)表達(dá)重組菌CGMCC No. 9628,泳道2為野生菌，泳道3為空白對(duì)照。
[0015] 圖3為重組菌與野生菌的TEM分析（a、c圖為重組菌，放大倍數(shù)相同；b、d圖為野 生菌，放大倍數(shù)相同）。
[0016] 圖4為重組菌與野生菌的平板抗逆性分析結(jié)果。
[0017] 圖5為重組菌與野生菌的模擬自溶實(shí)驗(yàn)結(jié)果（選取模擬自溶12h、24h、36h、48h、 60h、84h、108h的樣品，三角形：過(guò)表達(dá)重組菌CGMCC No. 9628 ;正方形：野生菌；圓形：敲除 重組菌）。
[0018] 圖6為模擬自溶實(shí)驗(yàn)過(guò)程中重組菌與野生菌的掃描電鏡（a、b為野生菌，c、d為重 組菌）
【具體實(shí)施方式】
[0019] 1，3-β -葡聚糖含量的測(cè)定方法如下：1. Omol/L氫氧化鈉溶液100mL，加入酵母泥 5g，在90°C下反應(yīng)3h。3000g離心15min，沉淀物水洗2次，然后用無(wú)水乙醇洗滌后蒸餾水 定容。取0. ImL樣品+1. 9mL蒸餾水+4. OmL剛果紅，混勾，于20°C精確保溫10min，于550nm 測(cè)吸光值。以2. OmL蒸餾水+4. OmL剛果紅做空白。
[0020] β -葡聚糖含量（mg/L) =ΑΧΚΧ1/νΧ20
[0021] A-試樣吸光值；
[0022] K-標(biāo)準(zhǔn)曲線上吸光度為1時(shí)對(duì)應(yīng)的β -葡聚糖μ g數(shù)；
[0023] V-吸取稀釋試樣體積的毫升數(shù)；
[0024] 20-試樣稀釋倍數(shù)。
[0025] 實(shí)施例Ifksl基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0026] 以釀酒酵母模式菌株W303 (模式菌株）為宿主菌，提取其基因組，通過(guò)PCR擴(kuò)增所 需片段：18SrDNA-up、18SrDNA-down、PGKl及fksl，以pUG6質(zhì)粒為模板擴(kuò)增KanMX片段。將 獲得的各個(gè)片段通過(guò)亞克隆的方式分別與PMD-19T vector連接，最終通過(guò)雙酶切獲得目的 片段。分子操作全過(guò)程如圖1所示。
[0027] 實(shí)施例2重組酵母菌的構(gòu)建與驗(yàn)證
[0028] 采用醋酸里化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將該目的片段導(dǎo)入酵母細(xì)胞，通過(guò)同源重組整合入酵母 基因組中，以G418抗性影印平板的方式篩選轉(zhuǎn)化子。結(jié)果如圖2所示。提取轉(zhuǎn)化子基因組， 設(shè)計(jì)引物1、2來(lái)篩選驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其中引物1截取ISSrDNA中間部分作為上游引物， PGKl中間位置作為下游