專利名稱:生產(chǎn)l-山梨糖的方法
本發(fā)明是關(guān)于用微生物的方法生產(chǎn)L-山梨糖。
L-山梨糖作為維生素C合成時(shí)的起始原料是很有價(jià)值的。在此以前，L-山梨糖已經(jīng)用微生物(如葡糖桿菌屬)氧化D-山梨糖醇來(lái)生產(chǎn)。
在用傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)L-山梨糖時(shí)，從D-山梨糖醇轉(zhuǎn)換成L-山梨糖最大的產(chǎn)率為93%，此外，還有較大量的5-果酮糖，D-果糖及/和2-葡萄糖酮酸副產(chǎn)品產(chǎn)生。為了降低維生素C生產(chǎn)中原料的成本，則需要增加從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化率，以及盡可能地抑制以上所提到的一些副產(chǎn)物的形成。
鑒于以上情況，本發(fā)明者對(duì)發(fā)展一個(gè)生產(chǎn)L-山梨糖的有效方法作了深入研究，并已經(jīng)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明是針對(duì)用微生物氧化D-山梨糖醇來(lái)生產(chǎn)L-山梨糖的一個(gè)改進(jìn)方法，它包括將適宜的微生物在下述培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，即在該微生物整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)控制培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧濃度在約1-4ppm范圍內(nèi)。
按照本發(fā)明的生產(chǎn)方法凡能將D-山梨糖醇氧化成L-山梨糖的任何微生物都可被應(yīng)用。這些細(xì)菌的例子包括葡糖桿菌屬的各種細(xì)菌，例如弱氧化葡糖桿菌即氧化葡糖桿菌。以下是這些適宜的菌株的部分目錄。弱氧化葡糖桿菌IFO3254，IFO3257，IFO12528，IFO3255，IFO3256，
IFO3258及IFO3291以及氧化葡糖桿菌IFO3189。
以上所例示的菌株以列入Osaka發(fā)酵研究所(IFO)發(fā)行，1984，第7版的培養(yǎng)目錄中，并存放于該研究所。
所謂“適宜微生物的生長(zhǎng)期”即指具體所培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)時(shí)間，包括誘導(dǎo)期或遲緩期到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這一時(shí)期隨不同微生物及所使用的培養(yǎng)條件而異，但可按照傳統(tǒng)的方法作出其生長(zhǎng)曲線圖就很容易看出來(lái)。一般講培養(yǎng)時(shí)間指在培養(yǎng)基內(nèi)從存在這可利用的氮源到氮源完全消耗為止，從許多實(shí)例看，它相當(dāng)于在培養(yǎng)開始后約9小時(shí)。
本發(fā)明中培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧濃度在整個(gè)生長(zhǎng)期中被控制在約1-4ppm。在這一時(shí)期中，減少溶解氧濃度的偏差是有利的。一般講，偏差應(yīng)控制在由上述濃度范圍中所選定值的±0.5ppm范圍以內(nèi)，偏差范圍最好在約0.3ppm以內(nèi)。
發(fā)酵過(guò)程中要隨時(shí)控制溶解氧的濃度，方法是連續(xù)檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)濃度和調(diào)節(jié)通氣流量，內(nèi)壓、攪拌條件和其它培養(yǎng)參數(shù)。檢測(cè)最好用對(duì)溶解氧敏感的元件作為氧電極溶解氧的濃度可通過(guò)如將通氣速率調(diào)節(jié)到大約0.1-1.0V.V.m范圍內(nèi)，把內(nèi)壓調(diào)在0-2.0公斤/厘米2范圍內(nèi)，逐步地把它們調(diào)節(jié)到一合適的配比，控制在一個(gè)特定水平。如果需要，調(diào)節(jié)攪拌速度也是有益的。
在生長(zhǎng)期之后，培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧濃度并不需要控制在特定水平。一般講，在生長(zhǎng)期終了所得到的吹氣及攪拌條件下培養(yǎng)過(guò)程可在溶解氧濃度約為0.5-4ppm水平繼續(xù)進(jìn)行。
本發(fā)明的特點(diǎn)是在適宜微生物的整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，控制培養(yǎng)基的溶解氧濃度范圍在約1-4ppm內(nèi)。其它條件的應(yīng)用如下述。
培養(yǎng)基內(nèi)的碳源，可采用D-山梨糖醇作為主要的物質(zhì)。另外可以加入D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露醇糖，乙醇等。一般在D-山梨糖醇濃度約為10-50W/V%時(shí)開始培養(yǎng)，最好是在30-50W/V%。
培養(yǎng)基內(nèi)氮源，可用玉米漿、棉子粉、酵母膏、干酵母、魚粉、肉膏、蛋白胨、酪蛋白的酸水解物，其它含氮有機(jī)物，硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨、磷酸銨、氯化銨、氨水、氨氣和其它無(wú)機(jī)氮化合物，氨基酸如谷氨酸鈉、丙氨酸等等，尿素以及其它有機(jī)氮化合物。
本發(fā)明內(nèi)，把合成培養(yǎng)基作為主要培養(yǎng)基是更為有利的。在這種情況下，D-山梨糖醇可用作合成培養(yǎng)基內(nèi)碳源的主要物質(zhì)，同時(shí)可加入D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露醇糖或乙醇。作為氮的來(lái)源，可采用如已提到過(guò)的硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨、磷酸銨或谷氨酸鈉。特別是利用醋酸銨更為有利。除以上所提的碳源和氮源外，為了微生物生長(zhǎng)的需要可適量加入不同的金屬、維生素、氨基酸及核酸。
本發(fā)明內(nèi)所用的合成培養(yǎng)基的成分例示如下%(重量/體積)D-山梨糖醇 10～40%磷酸二氫鉀 0.005～0.1%硫酸鎂(七水合物) 0.005～0.05%碳酸鈣 0.005～0.05%醋酸銨 0.02～0.05%谷氨酸鈉 0.05～0.2%硫酸亞鐵(七水合物) 0.00005～0.0005%硫酸錳 0.0000005～0.00005%尼克酰銨 0.0001～0.01%泛酸鈣 0.00001～0.001%
對(duì)氨基苯甲酸 0.000001～0.0001%維生素B20.00001～0.001%本發(fā)明中除溶解氧濃度外，其它一些培養(yǎng)條件都不是嚴(yán)格的，可以與那些傳統(tǒng)使用的相同。因此，培養(yǎng)溫度約為15-45℃，最好為25-45℃，而培養(yǎng)基的pH一般約為3.0-8.0，最好為3.5-6.5。培養(yǎng)時(shí)間一般約為10-100小時(shí)，最好為15-40小時(shí)。
培養(yǎng)后，可用傳統(tǒng)的方法從發(fā)酵液中回收L-山梨糖，例如，將發(fā)酵液過(guò)濾，用活性碳脫色，經(jīng)減壓濃縮以及用甲醇，乙醇，丙酮等結(jié)晶而得L-山梨糖。
根據(jù)本發(fā)明，用微生物氧化D-山梨糖醇的生產(chǎn)方法，與傳統(tǒng)方法相比L-山梨糖的產(chǎn)率有所增加。盡管在傳統(tǒng)方法中L-山梨糖的產(chǎn)率按D-山梨糖醇算最多可達(dá)到約93%，而根據(jù)本發(fā)明的方法比傳統(tǒng)方法至少可增加2-3%，而且可以減少如D-果糖，2-葡糖酮酸以及5-果酮糖等副產(chǎn)品的形成。結(jié)果與傳統(tǒng)方法相比，在維生素C生產(chǎn)中原料成本百分?jǐn)?shù)很高的L-山梨糖，可以較低的成本提供，因之在藥物及食品工業(yè)以及其它方面有廣泛用途的維生素C的生產(chǎn)成本也就降低。
實(shí)驗(yàn)例1使用后面實(shí)施例1中所描述的相同的微生物及培養(yǎng)基，在與實(shí)施例1相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，只是在生長(zhǎng)期內(nèi)培養(yǎng)基中溶解氧的濃度不同。經(jīng)培養(yǎng)后，L-山梨糖，D-果糖，2-葡糖酮酸以及5-果酮糖按D-山梨糖醇算所測(cè)定的產(chǎn)率如表1所示。
表1中，L-山梨糖，D-果糖，5-果酮糖及2-葡萄糖酮酸均是用高效液相色譜測(cè)定的。對(duì)于L-山梨糖，使用Waters Sugar Pack1(Waters公司)柱子，以104MEDTA鈣鹽水溶液為流動(dòng)相，和以一個(gè)高靈敏度的示差折光計(jì)作為檢測(cè)器。D-果糖和5-果酮糖是采用精氨酸顯色反應(yīng)方法測(cè)定的，使用一個(gè)ISA-07/S2504柱(日本Shimadzu公司)，3%硼酸(pH8.0流動(dòng)相)和螢光分光光度計(jì)。2-葡萄糖酮酸是采用紫外吸收方法(210nm)測(cè)定的，使用Shodex Ion Pack C-811柱(日本Showa DenKo公司)，以0.85%磷酸作流動(dòng)相。
當(dāng)按照本發(fā)明控制生長(zhǎng)期培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧濃度于特定范圍(參看所舉編號(hào)1，2和3)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)與較高溶解氧濃度下培養(yǎng)(參看所舉編號(hào)4，5和6)相比降低了如5-果酮糖，D-果糖以及2-葡萄糖酮酸等副產(chǎn)品的產(chǎn)生，并且增加了所需要的L-山梨糖的產(chǎn)率。結(jié)果如表1所示。
實(shí)驗(yàn)例2利用與實(shí)驗(yàn)例1所述相同的微生物和培養(yǎng)基，在與實(shí)驗(yàn)例1相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，除只是在生長(zhǎng)期內(nèi)培養(yǎng)基中的溶解氧濃度有變動(dòng)，如表2所示。
從表2結(jié)果看出溶解氧濃度的偏差控制在0.3ppm以內(nèi)時(shí)，L-山梨糖的產(chǎn)率較偏差在±0.6或±1.0ppm時(shí)為高。
實(shí)施例1將弱氧化葡糖桿菌IFO3254被接種到含有下列物質(zhì)的10升培養(yǎng)基內(nèi)20%D-山梨糖醇、0.2%谷氨酸鈉、0.018%碳酸鈣、0.003%尼克酰銨、0.0003%泛酸鈣、0.0001%維生素B2、0.0001%對(duì)氨基苯甲酸、0.047%磷酸二氫鉀、0.03%酵母膏、0.01%硫酸鎂、0.00015%硫酸亞鐵、0.00001%硫酸錳以及Actocol0.0005(日本Takeda化學(xué)工業(yè)公司)，經(jīng)30℃，培養(yǎng)24小時(shí)。將此種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有下列物質(zhì)的100升培養(yǎng)基內(nèi)30%D-山梨糖醇、0.039%醋酸銨、0.018%碳酸鈣、0.003%尼克酰銨、0.00025%泛酸鈣、0.0001%維生素B2、0.00001%對(duì)氨基苯甲酸、0.02%磷酸二氫甲、0.01%硫酸鎂、0.00015%硫酸亞鐵以及0.00001%硫酸錳。在30℃下培養(yǎng)，通氣流量及內(nèi)壓分別被調(diào)節(jié)在0.1-0.6v、v.m及表壓0.1-0.5公斤/厘米2以內(nèi)。從而在開始培養(yǎng)后的九個(gè)小時(shí)內(nèi)可保持其溶解氧濃度在2.5±0.5ppm的水平。然后，在生長(zhǎng)期內(nèi)及其后空氣流量為0.6v.v.m和內(nèi)壓為1.5公斤/厘米2表壓條件下進(jìn)行培養(yǎng)，總的培養(yǎng)時(shí)間為20小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中一方面，溶解氧濃度(DO)，D-山梨糖醇濃度與L-山梨糖濃度之間的關(guān)系以及另一方面，與培養(yǎng)時(shí)間之間的關(guān)系可在圖1中看出。圖1中，-○-表示溶氧濃度，-·-表示D-山梨糖醇濃度，以及-⊙-表示L-山梨糖濃度。以這種培養(yǎng)方式，L-山梨糖的累積產(chǎn)率按山梨糖醇計(jì)算為96.1%。
實(shí)施例2把弱氧化葡糖桿菌IFO3257接種在含有以下物質(zhì)的10升培養(yǎng)基中20%D-山梨糖醇，0.2%谷氨酸鈉，0.018%碳酸鈣，0.003%尼克酰銨，0.0003%泛酸鈣，0.0001%維生素B2，0.0001%對(duì)氨基苯甲酸，0.047%磷酸二氫鉀，0.03%酵母膏，0.01%硫酸鎂，0.00015%硫酸亞鐵，0.00001%硫酸錳，以及0.0005%Actocol，于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。將此種子培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)接到含有以下物質(zhì)的100升培養(yǎng)基中30%D-山梨糖醇，0.029%醋酸銨，0.018%碳酸鈣，0.003%尼克酰銨，0.00025%泛酸鈣，0.0001%維生素B2，0.00001%對(duì)氨基苯甲酸，0.02%磷酸二氫鉀，0.01%硫酸鎂，0.00015%硫酸亞鐵以及0.00001%硫酸錳。于30℃培養(yǎng)20小時(shí)。在培養(yǎng)期間，通氣流量，內(nèi)壓以及攪拌速度分別被調(diào)節(jié)為0.2-0.6v.v.m，0.2-1.5公斤/厘米表壓以及230-300轉(zhuǎn)/分。從而自開始培養(yǎng)后的九小時(shí)內(nèi)可保持溶解氧濃度在3.5±0.5ppm水平。然后，在生長(zhǎng)期及其后則在通氣流量為0.6v.v.m，內(nèi)壓為1.5公斤/厘米2表壓以及攪拌速率為300轉(zhuǎn)/分的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。L-山梨糖的累積產(chǎn)率按山梨糖醇計(jì)算為95.7%。
實(shí)施例3把弱氧化葡糖桿菌IFO12528接種于含有下列物質(zhì)的100升培養(yǎng)基中20%D-山梨糖醇，0.2%谷氨酸鈉，0.018%碳酸鈣，0.003%尼克酰銨，0.0003%泛酸鈣，0.0001%維生素B2，0.0001%對(duì)氨基苯甲酸，0.047%磷酸二氫鉀，0.03%酵母膏，0.01%硫酸鎂，0.00015%硫酸亞鐵，0.00001%硫酸錳以及0.0005%Actocol。于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。該種子培養(yǎng)液被轉(zhuǎn)接到含有下列物質(zhì)的1000升培養(yǎng)基內(nèi)30%D-山梨糖醇，0.039%醋酸銨，0.018%碳酸鈣，0.003%尼克酰銨，0.00025%泛酸鈣，0.0001%維生素B2，0.00001%對(duì)氨基苯甲酸，0.02%磷酸二氫鉀，0.01%硫酸鎂，0.00015%硫酸亞鐵以及0.00001%硫酸錳。于30℃培養(yǎng)20小時(shí)。通氣流量及內(nèi)壓分別調(diào)節(jié)在0.1-0.5v.v.m及0-1.5公斤/厘米2表壓范圍以內(nèi)。從而在開始培養(yǎng)后的九個(gè)小時(shí)內(nèi)可保持溶解氧濃度的水平在1.5±0.5ppm。然后，在生長(zhǎng)期以及而后在通氣流量為0.5vvm以及內(nèi)壓為1.5公斤/厘米2表壓下繼續(xù)培養(yǎng)。L-山梨糖的累積產(chǎn)率按山梨糖醇計(jì)算為96.3%。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用D-山梨糖醇的微生物氧化生產(chǎn)L-山梨糖的方法，它包括在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)適宜的微生物，在該微生物整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，將培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧濃度控制在大約1-4PPm。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中溶解氧濃度在1-4PPm的選定值時(shí)，其偏差應(yīng)控制在約±0.3ppm的范圍以內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)過(guò)程是以合成培養(yǎng)基作為主要培養(yǎng)基進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中合成培養(yǎng)基內(nèi)含有作為氮源的醋酸銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中微生物屬于葡糖桿菌屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中微生物屬于弱氧化葡糖桿菌種。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中微生物為氧化葡糖桿菌種。
專利摘要
在微生物氧化D-山梨糖醇生產(chǎn)L-山梨糖的方法中，是將一種適宜的微生物在下述培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，即在該微生物整個(gè)生長(zhǎng)期中，溶解氧濃度控制在大約1-4ppm的范圍。這樣，L-山梨糖的產(chǎn)率較通常的方法有很大的增加。
文檔編號(hào)C12R1/01GK86102773SQ86102773
公開日1986年11月12日 申請(qǐng)日期1986年4月22日
發(fā)明者金高一彥, 義永洋之, 山口高正 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan