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結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途的制作方法

文檔序號:85435閱讀:731來源:國知局
專利名稱:結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域
,涉及結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途。
背景技術(shù)
硫代硫酸硫轉(zhuǎn)移酶(thiosulfate sulfurtransferase,TST),是類似硫氰酸生成酶(rhodanese)的一種蛋白,廣泛存在于各種生物體中,包括細(xì)菌、植物以及哺乳動物,一般定位在線粒體上,但在低等脊椎動物如兩棲類、爬行類和魚,也存在于胞液中。含量隨種群、組織、性別、年齡而異。其主要功能為催化硫代硫酸鹽和氰根離子轉(zhuǎn)化為亞硫酸鹽和硫氰酸鹽從而達(dá)到代謝和解毒的目的,在Fe-S中心的Fe-S蛋白中作為一個硫插入酶產(chǎn)生氧化還原中心.,所以在鐵硫蛋白的合成或修復(fù)上不可缺少。且已證明TST可能與轉(zhuǎn)硫到tRNA核苷有關(guān),這一改變可能在翻譯過程中是重要的。如今TST已被用作研究蛋白穩(wěn)定性和折疊的模型,研究顯示Cys247殘基是TST的一個催化位點(diǎn),Arg186和Lys249在硫轉(zhuǎn)移功能中也是兩個主要的殘基,所有催化所需殘基在C端區(qū)域,而N端區(qū)域似乎與酶穩(wěn)定和活性結(jié)構(gòu)相關(guān)。
隨著結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)H37Rv基因組全序列破譯,明確了這一嚴(yán)重威脅人類健康的致病菌基因組共編碼了4種硫代硫酸硫轉(zhuǎn)移酶(CysA2[Rv0815c],CysA3[Rv3117],SseA[Rv3283],SseB[Rv2291]),說明這類蛋白對分枝桿菌非常重要。用中醫(yī)臨床上治療肺結(jié)核的毛莨科植物貓爪草作用MTB后TST表達(dá)下調(diào),表明它可能通過對該酶的抑制,對結(jié)核分枝桿菌的氨基酸代謝、轉(zhuǎn)錄水平、氰化物的解毒以及硫和鐵轉(zhuǎn)移等方面產(chǎn)生影響.結(jié)核菌在體內(nèi)主要宿主是巨噬細(xì)胞,低氧條件下,BCG的CysA2和CysA3表達(dá)明顯上調(diào),這說明該酶可能在細(xì)菌和人體內(nèi)持續(xù)感染中也有作用。
鑒于結(jié)核病已成為全球頭號傳染病殺手,在全球結(jié)核病的疫情呈發(fā)展中國家居高不下,發(fā)達(dá)國家上升的嚴(yán)峻形勢。深入研究引起該病的結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理,了解其生存所需重要蛋白結(jié)構(gòu)和功能,掌握結(jié)核菌調(diào)控機(jī)制,將為今后開發(fā)新藥,最終消滅這一纏繞人類多個世紀(jì)的頑疾打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供,1.結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌;2.固定化的結(jié)核菌硫氰酸酶工程菌或者純化酶;3.結(jié)核菌硫氰酸酶進(jìn)行脫毒和生物轉(zhuǎn)化的方法。4.含有SseB的DNA疫苗或者亞單位疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明包括以下內(nèi)容1.結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌;2.固定化的結(jié)核菌硫氰酸酶工程菌或者純化酶;3.結(jié)核菌硫氰酸酶進(jìn)行脫毒和生物轉(zhuǎn)化的方法。4.含有SseB的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù),從結(jié)核菌基因組擴(kuò)增SseB基因,在大腸桿菌等適宜的宿主表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)行抗體制備,亞單位疫苗制備以及DNA疫苗制備并檢測效果。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基或者M(jìn)iddlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)到合適的菌體濃度,按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌的構(gòu)建按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法,將基因組DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體,轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶?,通過一定的選擇標(biāo)記,收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法,將目標(biāo)基因克隆到載體,轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,篩選轉(zhuǎn)化子。分別根據(jù)已知的結(jié)核菌入侵人體和動物模型可能遭遇的不利環(huán)境,進(jìn)行人工模擬,從基因組表達(dá)文庫篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子,并進(jìn)一步驗證。
4.利用含有功能基因的重組菌,進(jìn)行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法,構(gòu)建了結(jié)核菌sseB基因重組菌,純化了該蛋白,構(gòu)建了藥物篩選模型,利用純化的蛋白作為亞單位疫苗組分,免疫了動物,取得了良好效果,采用固定化技術(shù)。
圖1.結(jié)核菌sseB基因PCR產(chǎn)物。M DNA分子量標(biāo)記;1 PCR產(chǎn)物。
圖2.SDS-PAGE分析包涵體和上清中重組蛋白sseB。1-2 30℃,IPTG1.0mmol/L,10h;包涵體和上清,3-4.25℃,IPTG1.0mmol/L,6h;包涵體和上清液,M小分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施方式1材料和方法1.1材料1.1.1菌株MTB H37Rv基因組DNA;克隆宿主E.coli DH5α;表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)由本研究所保存。
1.1.2載體pET-28a(+)為本研究所保存。
1.1.3主要試劑蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶、EcoRI、HindIII為TaKaRa公司產(chǎn)品;核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)為鼎國公司產(chǎn)品;卡那霉素、IPTG、RNase A為Sigma公司產(chǎn)品;低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品。
1.2目的基因PCR擴(kuò)增和克隆、鑒定根據(jù)GenBank中MTB sseB基因序列,自行設(shè)計一對PCR引物(由北京賽百盛公司合成),序列為5′-AGCGAATTCGTGCAAGCCCGT-3′;P25′-GCCAAGCTTCTATGCAGTGCCA-3′(劃線序列分別為EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn))。以MTB H37Rv基因組DNA為模板,P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(總體積20μl)10×Buffer 2μl,P1、P2(10pmol/μl)各1μl,dNTP(10mmol/l,含Mg2+)2μl,模板DNA 1μl(200ng/μl),滅菌去離子水12.5μl,Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)。反應(yīng)條件94℃ 5min;94℃ 1min,58.5℃ 1min,72℃ 1min,共35個循環(huán),72℃延伸5min。
以EcoRI、HindIII雙酶切PCR純化產(chǎn)物和載體pET-28a(+),經(jīng)T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)克隆宿主E.coli DH5α中通過質(zhì)粒大小、酶切分析及PCR擴(kuò)增鑒定重組克隆,獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sseB,由北京賽百盛公司進(jìn)行測序。
1.3 SseB基因序列識別和功能預(yù)測目的基因序列在線遞交到DAS(http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/tmdas.cgi)、SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TargetP進(jìn)行在線蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、信號肽和剪切位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位。并用生物軟件DNAstar中MegAlign進(jìn)行基因序列比對及進(jìn)化樹繪制,在線用SWISSMODEL軟件進(jìn)行目的蛋白活性區(qū)域和三維模建預(yù)測。
1.4原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白表達(dá)可溶性分析將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sseB轉(zhuǎn)化至感受態(tài)表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)中,經(jīng)篩選獲得原核表達(dá)重組菌pET-32a(+)-sseB1。將原核表達(dá)重組克隆接種于7mL(含卡那霉素50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,37℃ 200r/min培養(yǎng)過夜,次日取2ml接種于50mL(含卡那霉素50μg/mL)LB培養(yǎng)基中,37℃ 220r/min培養(yǎng)至OD600為0.8,加1mmol/ml IPTG誘導(dǎo),分別取30℃、10h和25℃ 6h兩條件下菌液超聲波破碎,4℃、15000g離心10min,取上清和沉淀分別進(jìn)行15%的SDS-PAGE分析,檢測目的蛋白的存在形式,以確定純化方案。
2結(jié)果和分析2.1 PCR擴(kuò)增、重組子的鑒定及序列分析以結(jié)核分枝桿菌染色體DNA為模板,以sseA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見1條約830bp的DNA片段,與預(yù)期DNA片段大小一致(圖1)。sseB純化的PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,通過質(zhì)粒大小、酶切分析、PCR擴(kuò)增及序列分析鑒定重組質(zhì)粒。以EcoRI、HindIII雙酶切重組質(zhì)粒,得到約5300bp的pET-28a(+)線性片段和約830bP的插入片段(圖2)。序列分析結(jié)果與GenBank MTB sseA基因序列對比完全吻合,表明成功地構(gòu)建出sseB基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。
2.2蛋白表達(dá)可溶性分析IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達(dá)情況如圖5所示。在分子量約為30KD處包涵體和上清都出現(xiàn)蛋白,與目的蛋白分子量一致,可見這一蛋白在包涵體和上清中都存在,且25℃時僅誘導(dǎo)6小時上清中目的蛋白就已比30℃10h的多。
權(quán)利要求
1.結(jié)核菌硫氰酸酶,其特征是含有結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌以及純化的重組酶。
2.權(quán)利要求
1所述的結(jié)核菌硫氰酸酶,其特征在于硫氰酸酶是結(jié)核菌的Rv2291基因編碼的SseB。
3.權(quán)利要求
1所述的結(jié)核菌硫氰酸酶,其特征在于所述重組菌為大腸桿菌。
4權(quán)利要求
1或2所述的結(jié)核菌硫氰酸酶的用途,其特征是利用固定化的重組菌或者純化酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化或者污染物清除。
5.權(quán)利要求
1或2所述的結(jié)核菌硫氰酸酶的用途,其特征是利用重組菌或者純化酶進(jìn)行酶調(diào)節(jié)分子的篩選。
6.結(jié)核分枝桿菌SseB基因在結(jié)核病診斷和藥物治療效果監(jiān)控中的用途,其特征是利用重組表達(dá)的SseB的抗體或者抗體類似分子進(jìn)行免疫檢測。
7.結(jié)核分枝桿菌SseB基因在DNA疫苗或者亞單位疫苗中的應(yīng)用,其特征是利用結(jié)核分枝桿菌SseB基因及其產(chǎn)物,作為疫苗組分,預(yù)防結(jié)核病。
專利摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域
,涉及結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途,尤其是結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌,固定化的結(jié)核菌硫氰酸酶工程菌或者純化酶,結(jié)核菌硫氰酸酶進(jìn)行脫毒和生物轉(zhuǎn)化的方法,含有SseB的DNA疫苗或者亞單位疫苗。
文檔編號C12N15/52GK1995335SQ200610095340
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 陳宏玲, 王洪海 申請人:西南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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