專利名稱:結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白基因及其用途，尤其是在冷休克蛋白活性調(diào)控分子篩選、利用冷休克蛋白的結(jié)核病預(yù)防性疫苗和結(jié)核病診斷試劑方面的用途。
背景技術(shù)：
全球結(jié)核病仍然是傳染病首位殺手，全球結(jié)核病流行日益加劇，世界衛(wèi)生組織(WHO)于1993年史無前例地宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”，1998年又重申遏制結(jié)核病的行動刻不容緩。2004年有900萬新發(fā)結(jié)核病例，另有約200萬結(jié)核病患者死亡[6]。全球耐多藥結(jié)核病的發(fā)生率上升和廣泛傳播給結(jié)核病控制工作帶來了嚴(yán)重威脅，為了開發(fā)新的藥物用于結(jié)核病的治療，尋找其病原菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，以下簡稱MTB)中的抗原蛋白作為藥物治療的靶標(biāo)將會是今后抗結(jié)核藥物研發(fā)的一個重要方向。
冷休克蛋白(cold shock protein，以下簡稱CSP)是與熱休克蛋白(heat shock protein，以下簡稱HSP)相對的另一類分子伴侶。它們是高度保守并且?guī)缀醮嬖谟谒形锓N。根據(jù)它們序列的同源性和分子量而分為幾個家族，如hsp110，hsp100，hsp90，hsp60，hsp40，hsp10等。HSP最初是在熱刺激和其他壓力作用時發(fā)現(xiàn)的，接著發(fā)現(xiàn)其陪伴的許多蛋白都是具有各種功能的，它們即使在非壓力存在中，在蛋白成功折疊，組裝，胞內(nèi)定位，分泌，調(diào)節(jié)和降解方面都有重要作用。HSP可以識別和結(jié)合其他蛋白，從而防止后者與另外的蛋白分子不合適宜的錯誤作用。對蛋白的折疊結(jié)合和釋放通常是由核酸的結(jié)合或水解來實現(xiàn)的。伴侶的活性喪失許多嚴(yán)重的人類疾病的發(fā)生，如在癌癥中其表達水平就有明顯變化。HSP的研究已經(jīng)較為涉及各個領(lǐng)域，如水生和路上環(huán)境壓力，環(huán)境變化的生物指示劑，生物與宿主的寄生以及共生關(guān)系，衰老和凋亡等[29]。而在進化方面，HSP被認(rèn)為是潛在的基因突變的緩沖劑(buffering agent)，在緩沖外界環(huán)境壓力變化引起的基因改變，并且適時釋放這些變化來使得物種適應(yīng)環(huán)境變化的需要，因而“緩沖劑”的缺失或突變等都會造成適應(yīng)力的下降[31]。近來分枝桿菌研究最多則是在于分枝桿菌的HSP與癌癥的關(guān)系，在抗原呈遞方面的作用[30]，以及其與自身免疫系統(tǒng)疾病的聯(lián)系，還有就是利用HSP亞結(jié)構(gòu)域來改造卡介苗(BCG)。然而關(guān)于分子伴侶的研究仍然存在許多問題無法解釋，通過研究CSP可以有助于我們對這兩類分子伴侶進行對比和深入研究。
CSP是廣泛存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中的應(yīng)激蛋白，在保護機體幫助細(xì)胞適應(yīng)低溫環(huán)境方面起著重要的作用。通過與特異序列結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，克服低溫的毒害效應(yīng)。大多數(shù)CSP是在溫度降低的起始階段合成，其基本功能在于DNA的包裝、轉(zhuǎn)錄、RNA的降解、翻譯以及核糖體組裝等[22]，它與細(xì)菌的多個生理過程有著密切的聯(lián)系，如對低溫的適應(yīng)、細(xì)胞生長的控制、營養(yǎng)脅迫。曾有文獻報道的研究過CSP的微生物主要是嗜溫菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、耶耳辛氏腸炎桿菌(Yersinia enterocolitica)[16]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[25]、乳酸桿菌(Lactobacillus casei)[15]、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)[14]等，嗜冷菌如Methanogenium frigidum和Methanococcoides burtonii[17]等，嗜熱菌如嗜熱桿菌(Bacillus stearothermophilus)[18]和熱容芽孢桿菌(Bacillus caldolyticus)[19]等。CspA家族是研究最多的冷激蛋白家族，1987年首次從大腸桿菌(Escherichia coli)中分離的CspA[1]，是大腸桿菌中最主要的冷休克蛋白之一，它與真核生物的Y-box結(jié)合蛋白具有極高的同源性[2]，但其結(jié)合序列的特異性較低；在大腸桿菌中已對其進行克隆、測序，功能、結(jié)構(gòu)、調(diào)控的研究也已取得一定進展，隨后從枯草芽孢桿菌中分離出主要冷休克蛋白CspB，并對該蛋白進行異源過量表達，結(jié)晶和X-ray分析[3]，發(fā)現(xiàn)CspB作為分子伴侶，與單鏈核酸中的ATTGG序列和CCAAT序列具有較高的親合性[4]。而在結(jié)核分枝桿菌中的CspA是培養(yǎng)上清中濾液蛋白(culturefiltrate protein，以下簡稱CFP)的一種，但是它并不含典型的信號肽序列，其外排機制尚不清楚，推測可能除了信號肽，脂質(zhì)對于結(jié)核菌細(xì)胞蛋白的定位也極其重要[12]。CFP在抗結(jié)核疫苗的開發(fā)中，對于尋找特異的T細(xì)胞抗原方面發(fā)揮著重要作用。CspA作為CFP，研究其在結(jié)核分枝桿菌中的性質(zhì)、功能，及其與致病的關(guān)系等可以作為尋求小分子化合物用于治療結(jié)核病的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供，1.一種重組表達結(jié)核菌冷休克蛋白的工程菌；2.獲得大量純化的冷休克蛋白，進行抗體制備；3.利用含有冷休克蛋白的工程菌作為藥物靶標(biāo)研發(fā)新的藥物的模型；4.含有冷休克蛋白的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，從結(jié)核菌基因組擴增冷休克蛋白基因，在大腸桿菌等適宜的宿主表達，純化表達產(chǎn)物，進行抗體制備，亞單位疫苗制備以及DNA疫苗制備并檢測效果。
實現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為總體技術(shù)方案是克隆包括提取結(jié)核菌基因組，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，將基因組DNA克隆到合適的大腸桿菌宿主細(xì)胞。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌的構(gòu)建按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶?，通過一定的選擇標(biāo)記，收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。分別根據(jù)已知的結(jié)核菌入侵人體和動物模型可能遭遇的不利環(huán)境，進行人工模擬，從基因組表達文庫篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子，并進一步驗證。
4.利用含有功能基因的重組菌，進行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法，得到了1.一種重組表達結(jié)核菌冷休克蛋白的工程菌；2.獲得大量純化的冷休克蛋白，進行抗體制備；3.利用含有冷休克蛋白的工程菌作為藥物靶標(biāo)研發(fā)新的藥物的模型；4.含有冷休克蛋白的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用。
圖1.重組表達的結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白產(chǎn)物。
具體實施方式1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和培養(yǎng)MTB H37Rv由重慶市肺科醫(yī)院提供并滅活。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、質(zhì)粒pET32a和宿主菌E.coli BL21(DE3)為本實驗室保存。
1.1.2試劑限制性內(nèi)切酶Nco I和EcoR I、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，TaqDNA聚合酶、dNTP和buffer、IPTG購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，Biospin膠回收試劑盒購自博日科技有限公司，Ni2+-Sepharose和KTAprime蛋白純化系統(tǒng)購自Amersham Biosciences。
1.2 PCR擴增根據(jù)cspA基因序列設(shè)計一對引物，P15′-CATGCCATGGGAATGCCACAGG-3′(劃線堿基為Nco I酶切位點)；P25′-CGGAATTCTCAGAGCGAGCGGAC-3’(劃線堿基為EcoRI酶切位點)。MTB基因組DNA按文獻[5]抽提。以MTB基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件96℃ 5min；96℃ 45s，60.4℃ 45s，72℃ 1min 30s，30個循環(huán)；72℃ 10min。DNA測序由賽百盛公司進行。PCR產(chǎn)物按照文獻[7]稍作修改進行純化。
1.3 cspA基因的克隆和表達擴增的片段純化后經(jīng)Nco I和EcoR I雙酶切后克隆至同樣酶切的pET32a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α。對重組質(zhì)粒進行PCR驗證后，再轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，重組質(zhì)粒進行DNA測序分析。將E.coli BL21(DE3)/pET32a-CspA及E.coli BL21(DE3)/pET32a接種于含有100μg/mL氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。當(dāng)OD600達到0.6左右時，加入IPTG(終濃度為1mmol/ml)，培養(yǎng)4h，收集菌體，用原菌液體積1/10的1×Ni2+-Sepharose結(jié)合緩沖液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，2mmol/LDTT，5％的甘油，pH8.0)重懸細(xì)胞，超聲破碎。離心收集上清。
1.4重組CspA蛋白的純化將裂解物過濾后上清首先用80℃熱處理初次純化[27]。將上清在80℃溫育3min后，取出置于冰浴。與4℃以最大轉(zhuǎn)速離心10min，取上清，用Benzonase核酸酶處理，去處蛋白中的核酸。經(jīng)0.45um的濾器過濾，用Ni2+-Sepharose親合柱對蛋白進行再次純化。用5倍體積的1×Ni2+-Sepharose洗滌緩沖液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，2mmol/L DTT，5％的甘油，pH8.0)洗柱。然后用洗滌緩沖液和洗脫緩沖液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，500mM咪唑，2mmol/L DTT，5％的甘油，pH8.0)進行梯度洗脫，洗脫液總體積設(shè)為200ml，并收集洗脫峰，進行SDS-PAGE檢測。含有高純度CspA重組蛋白的洗脫液以二次蒸餾水在4℃進行透析過夜，冷干后于-20℃保藏。
1.5蛋白質(zhì)濃度測定SDS-PAGE凝膠染色后，利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，然后通過分析軟件 對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析，確定CspA重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量為 。蛋白質(zhì)濃度采用Bradford等 的方法進行測定。
1.6重組蛋白活性測定按文獻[8]中采用胰蛋白酶消化法進行活性鑒定其結(jié)合單鏈核酸的性質(zhì)[13]。在Tris-MgCl2-NaCl緩沖液(20mM的Tris-HCl，5mM MgCl2，50mM NaCl，pH8.6)加入61mg/mL的CspA和23umol/L的35bp的單鏈DNA，反應(yīng)體系中加入15mg/mL的胰蛋白酶，30℃反應(yīng)，不同時間(2min，4min，6min，10min，15min，30min，60min，120min，180min，240min，300min和360min)取等量進行SDS-PAGE檢測。以BL21(pET32a)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株純化所得蛋白作為對照。
結(jié)果2.1 cspA基因序列分析及其同源性比較克隆的cspA基因序列與NCBI公布的序列一致，基因bank中的登陸號為NC000962。該基因具有較高的GC含量(59.4％)。將該基因序列與分枝桿菌中其他CSPs進行序列比對。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，鳥分枝桿菌副結(jié)核亞型(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)，麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)等分枝桿菌中存在冷休克蛋白。除了恥垢分枝桿菌為快生型，而其他幾類都屬于慢生型分枝桿菌。圖1中顯示分枝桿菌中的Csps的基因系統(tǒng)進化樹，可以看出csp是高度保守的，在牛型和人型結(jié)核分枝桿菌中cspA都是一樣的，而麻風(fēng)分枝桿菌也只有少許變化。鳥分枝桿菌副結(jié)核亞型中的cspA在NCBI中檢索到兩類。人型和牛型結(jié)核分枝桿菌的cspB序列也完全一樣。cspA基因起始密碼子的43位到102位具有′Cold-shock′DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特點。分析蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它M.leprae中的CSP有97.0％的同源性，與M.smegmatis 92.55％同源性。在蛋白的N-末端包含′Cold-shock′結(jié)構(gòu)域(CSD)，因而屬于′Cold-shock′蛋白家族。
2.2 cspA基因的克隆與表達經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，E.coli BL21(DE3)/pET32a-CspA及E.coli BL21(DE3)/pET32a主要以可溶形式表達CspA，經(jīng)凝膠掃描分析確定約占總蛋白的？％(圖2)。分子量與預(yù)期的的大小基本一致，約為24kD。
2.3重組CspA蛋白的純化重組蛋白的質(zhì)粒部分含有硫氧還蛋白，可以在80℃熱處理時保持一定的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過一次處理可以去掉大量的雜蛋白。再經(jīng)過Ni2+-Sepharose親合柱可有效結(jié)合帶有His-tag的重組蛋白。經(jīng)過分離，Ni2+-Sepharose洗脫部分就含有較純的重組蛋白。
權(quán)利要求
1.結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白基因，其特征是表達結(jié)核菌冷休克蛋白的重組工程菌、純化的重組酶以及利用純化的酶或工程菌進行結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白調(diào)節(jié)分子的篩選。
2.結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白在結(jié)核病診斷和藥物治療效果監(jiān)控中的用途，其特征是利用重組表達的冷休克蛋白的抗體或者抗體類似分子進行免疫檢測。
3.結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白在DNA疫苗或者亞單位疫苗中的應(yīng)用，其特征是利用結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白及其產(chǎn)物，作為疫苗組分，預(yù)防結(jié)核病。
專利摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白基因及其用途，尤其是在冷休克蛋白活性調(diào)控分子篩選、利用冷休克蛋白的結(jié)核病預(yù)防性疫苗和結(jié)核病診斷試劑方面的用途。
文檔編號G01N33/53GK1995352SQ200610095337
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 陳長恒, 王洪海 申請人:西南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan