專利名稱:使用腸桿菌科細菌產(chǎn)生l-氨基酸的方法
使用腸桿菌科細菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法[0001]本申請是申請日為2007年7月12日，申請?zhí)枮椤?00780027157.1”(國際申請?zhí)枮椤埃?7見2007/064304”)，名稱為“使用腸桿菌科細菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。技術(shù)領(lǐng)域：
[0002]本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，具體涉及通過使用具有增強的醇脫氫酶活性的細菌進行發(fā)酵來產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。
背景技術(shù)：
[0003]常規(guī)而言，在工業(yè)上通過利用從天然來源獲得的微生物菌株或其變體的發(fā)酵方法產(chǎn)生L-氨基酸。通常對微生物進行修飾以提高L-氨基酸的產(chǎn)率(production yield)。[0004]已經(jīng)報道過許多提高L-氨基酸產(chǎn)率的技術(shù)，包括用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(美國專利N0.4，278，765)。用于提高產(chǎn)率的其它技術(shù)包括增加氨基酸生物合成中涉及的酶的活性和/或使目標酶對產(chǎn)生的L-氨基酸的反饋抑制脫敏(美國專利Nos.4，346，170,5,661,012和 6，040，160)。[0005]通過優(yōu)化期望的化合物的主要生物合成途徑，能夠?qū)崿F(xiàn)對產(chǎn)生L-氨基酸的菌株的進一步改進。通常這通過為細菌補充越來越大量的碳源(如糖，例如葡萄糖)來實現(xiàn)。無論通過PTS的葡萄糖轉(zhuǎn)運的效率為何,但是在高產(chǎn)菌株中對碳源的獲取(access)卻仍可能不足。另一種增加產(chǎn)生L-氨基酸的菌株的生產(chǎn)力和降低目標L-氨基酸成本的方法是使用替代性(alternative)的碳源,如醇,例如乙醇。[0006]大腸桿菌的醇脫氫酶(乙醇氧化還原酶，AdhE)是一種多功能酶，其通過兩個連續(xù)的NADH-依賴性乙酰輔酶A還原反應(yīng)，以及使將丙酮酸切割成乙酰輔酶A和甲酸的丙酮酸甲酸裂合酶來催化乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。[0007]AdhE在葡萄糖存在下在厭氧生長的過程中大量合成(約3xl04拷貝每細胞)，并形成稱為螺旋體(spirosome)的螺旋結(jié)構(gòu)，這些螺旋結(jié)構(gòu)大約0.22 μ m長，含有 40-60 個 AdhE 分子(Kessler, D.，Herth, W.和 Knappe, J.，J.Biol.Chem.，267，18073-18079 (1992))。當將大腸桿菌細胞培養(yǎng)從厭氧條件轉(zhuǎn)換至有氧條件時，adhE基因的轉(zhuǎn)錄降低，并維持在于厭氧條件下所得范圍的10%以內(nèi)(Chen，Y.Μ.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.173, 8009-8013 (1991) !Leonardo, M.R.，Cunningham, P.R.和 Clark, D.P., J.Bacteriol.175, 870-878 (1993) ；Mikulskis, A., Aristarkhov, A.和 Lin, E.C.C.，J.Bacteriol.179，7129-7134(1997) ；MembriIlo-Hernandez, J.和Lin, E.C.C.，J.Bacteriol.181，7571-7579 (1999))。翻譯也受到調(diào)節(jié)，并且需要 RNA 酶III (Membrillo-Hernandez, J.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.181, 7571-7579(1999)；Aristarkhov, A.等，J.Bacteriol.178，4327-4332 (1996))。已將 AdhE 鑒定為大腸桿菌細胞經(jīng)受過氧化氫應(yīng)激 (hydrogen peroxide stress)時的主要祀物之一(Tamarit, J., CabiscoI, E.和 Ros, J., J.Biol.Chem.273, 3027-3032 (1998))。[0008]盡管由AdhE催化的兩個NADH-偶聯(lián)反應(yīng)具有可逆性，野生型大腸桿菌也無法在乙醇作為唯一碳源和能源存在時生長，因為adhE基因在有氧條件下以低水平轉(zhuǎn)錄(Chen，Y.Μ.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.73, 8009-8013 (1991) ; Leonardo, M.R., Cunningham, P.R.&Clark, D.P.，J.Bacteriol.175870-878 (1993))，并且在有氧代謝過程中 AdhE 蛋白的半衰期因金屬催化的氧化(MCO)而縮短。[0009]已經(jīng)分離并表征了能夠在乙醇作為唯一碳源和能源時進行有氧生長的大腸桿菌突變體(在37° C，具有取代Ala267Thr的突變體，在乙醇存在下生長，倍增時間為240分鐘；具有取代Ala267Thr和Glu568Lys的變體，倍增時間為90分鐘)(Membrillo-Hernandez, J.等,J.Biol.Chem.275, 33869-33875(2000) ；Holland-Staley,C.A.等，J.Bacteriol.182, 6049-6054(2000)) 0顯然，當按照與生理上的方向相反的方向催化兩個連續(xù)反應(yīng)時，對于野生型AdhE而言乙酰輔酶A的形成是速率受限的。作為通過AdhE中的A267T取代來改進Vmax的交換(tradeoff)是酶的熱穩(wěn)定性降低和對MCO損壞的敏感性增加。AdhE中的第二氨基酸取代E568K(A267T/E568K)部分恢復了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和對MCO損壞的抗性，而未進一步改進在底物氧化中的催化效率。[0010]然而，迄今尚未有報道使用腸桿菌科(Enterobacteriaceaefamily)細菌通過在含有乙醇的培養(yǎng)基中發(fā)酵來增加L-氨基酸的產(chǎn)生，所述腸桿菌科細菌具有活性增強的對有氧失活(aerobic inactivation)有抗性的天然醇脫氫酶或突變醇脫氫酶。[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明的目的包括提高產(chǎn)生L-氨基酸的菌株的生產(chǎn)力，和提供使用這些菌株產(chǎn)生非芳族或芳族L-氨基酸的方法。[0013]通過發(fā)現(xiàn)在處于有氧培養(yǎng)條件下有功能的啟動子的調(diào)控下表達編碼醇脫氫酶的天然或突變adhE基因使L-氨基酸(例如，L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和/或L-亮氨酸)的產(chǎn)生增強而達到了該目的。[0014]本發(fā)明的目的是提供用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括:[0015]A)在含有乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有醇脫氫酶的腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細菌，和[0016]B)從培養(yǎng)基中分離L-氨基酸，[0017]其中編碼所述醇脫氫酶的基因在非天然啟動子的調(diào)控下表達，所述非天然啟動子在有氧培養(yǎng)條件下有功能。[0018]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述非天然啟動子選自下組:Ptac、Plac、
Ptrp^ Ptrc^Rin Pl。[0019]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脫氫酶對有氧失活有抗性。[0020]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脫氫酶源于選自下組的細菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(ErwiniacaFotovora)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、 Pantoea ananatis (菠蘿泛菌)、植物乳桿菌(LactobacillusPI ant arum)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。[0021]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脫氫酶包含SEQ IDN0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸殘基被替代為另一種除天冬氨酸殘基之外的氣基酸殘基。[0022]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脫氫酶包含SEQ IDNO:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸殘基被替代為賴氨酸殘基。[0023]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脫氫酶具有至少一個額外的突變，該突變能夠改進所述細菌在含有乙醇作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中的生長。[0024]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述額外的突變選自下組:[0025]A)用另一種氨基酸殘基替代SEQ ID NO:2中在位置560的谷氨酸殘基；[0026]B)用另一種氨基酸殘基替代SEQ ID NO:2中在位置566的苯丙氨酸殘基；[0027]C)用其它氨基酸殘基替代SEQ ID NO:2中分別在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和[0028]D)以上各項的組合。[0029]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述額外的突變選自下組:[0030]A)用賴氨酸殘基替代SEQ ID NO:2中在位置560的谷氨酸殘基；[0031]B)用纈氨酸殘基替代SEQ ID NO:2中在位置566的苯丙氨酸殘基；[0032]C)用甘氨酸殘基、纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基和纈氨酸殘基分別替代SEQ ID勵:2中在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和[0033]D)以上各項的組合。[0034]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述細菌屬于選自下組的屬:埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)和摩根氏菌屬(Morganella)。[0035]本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸選自下組:L_蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。[0036]具體地，本發(fā)明涉及如下方面:[0037]1.一種用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括:[0038]A)在含有乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有醇脫氫酶的腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細菌，和[0039]B)從培養(yǎng)基中分離L-氨基酸，[0040]其中編碼所述醇脫氫酶的基因在非天然啟動子的調(diào)控下表達，所述啟動子在有氧培養(yǎng)條件下有功能。[0041]2.根據(jù)項I的方法，其中所述非天然啟動子選自下組[0042]3.根據(jù)項I或2的方法，其中所述醇脫氫酶對有氧失活有抗性。[0043]4.根據(jù)項1-3中任一項的方法，其中所述醇脫氫酶源于選自下組的細菌:大腸桿菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、 鼠傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、Pantoeaananatis、植物乳桿菌和乳酸乳球菌。[0044]5.根據(jù)項1-4中任一項的方法，其中所述醇脫氫酶包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸殘基被替代為不是天冬氨酸殘基的另一種氨基酸殘基。[0045]6.根據(jù)項1-4中任一項的方法，其中所述醇脫氫酶包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸殘基被替代為賴氨酸殘基。[0046]7.根據(jù)項5或6的方法，其中所述醇脫氫酶具有至少一個額外的突變，該突變能夠改進所述細菌在含有乙醇作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中的生長。[0047]8.根據(jù)項7的方法，其中所述額外的突變選自下組:[0048]A)用另一種氨基酸殘基替代SEQ ID NO:2中位置560的谷氨酸殘基；[0049]B)用另一種氨基酸殘基替代SEQ ID NO:2中位置566的苯丙氨酸殘基；[0050]C)用其它氨基酸殘基替代SEQ ID NO:2中分別在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和[0051]D)以上各項的組合。[0052]9.根據(jù)項7的方法，其中所述額外的突變選自下組:[0053]A)用賴氨酸殘基替代SEQ ID NO:2中位置560的谷氨酸殘基；[0054]B)用纈氨酸殘基替代SEQ ID NO:2中位置566的苯丙氨酸殘基；[0055]C)用甘氨酸殘基、纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基和纈氨酸殘基分別替代SEQ ID勵:2中分別在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和[0056]D)以上各項的組合。[0057]10.根據(jù)項1-9中任一項的方法，其中所述產(chǎn)生L-氨基酸的細菌屬于選自下組的屬:埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬和摩根氏菌屬。[0058]11.根據(jù)項1-10中任一項的方法，其中所述L-氨基酸選自下組:L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。[0059]優(yōu)選實施方案詳述[0060]醇脫氫酶是Fe2+-依賴性多功能蛋白質(zhì)，其在N-末端具有乙醛-輔酶A脫氫酶活性，在C-末端具有鐵依賴性醇脫氫酶活性，和丙酮酸甲酸裂合酶失活酶(deactivase)活性。同物異名包括B1241、AdhC和Ana。在有氧條件下，在有氧代謝過程中的活性AdhE蛋白的半衰期因金屬催化的氧化而縮短。[0061]在本發(fā)明中，短語“醇脫氫酶的活性”的意思是催化醇變成醛或酮的NAD-依賴性氧化反應(yīng)的活性。醇脫氫酶(EC1.1.1.1)良好地作用于乙醇、正丙醇和正丁醇。醇脫氫酶的活性能夠通過例如由Membrillo-Hernandez, J.等描述的方法(J.Biol.Chem.275，33869-33875(2000))來檢測和度量。[0062]醇脫氫酶由adhE基因編碼，并且可以使用源自或天然存在于(native to)屬于以下菌屬的細菌的任何adhE基因作為本發(fā)明中的醇脫氫酶基因:埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬(Yershinia)、泛菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬。adhE基因的來源的具體實例包括細菌菌株，如大腸桿菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、腸沙門氏菌(Salmonella enterica)、鼠傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudo tuberculosis) > Pantoea ananatis、 植物乳桿菌和乳酸乳球菌。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌醇脫氫酶的野生型adhE基因(與GenBank登錄號NC_000913.2，g1:49175990的序列中編號1294669-1297344互補的核苷酸號)。adhE基因位于大腸桿菌K-12染色體上的ychG和ychE ORF之間。也已經(jīng)闡明編碼醇脫氫酶的其它adhE基因:來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的adhE基因(GenBank登錄號NC_004547.2; g1:50121254的序列中的核苷酸號2634501-2637176);來自腸沙門氏菌的adhE基因(GenBank登錄號NC_004631.1; g1:29142095的序列中的核苷酸號1718612-1721290);來自鼠傷寒沙門氏菌的adhE基因(GenBank登錄號U68173.1 ;g1:1519723的序列中的核苷酸號1-2637);來自弗氏志賀氏菌的adhE基因(與GenBank登錄號NC_004741.1; g1: 30062760的序列中的核苷酸號1290816-1293491互補的核苷酸號)；來自假結(jié)核耶爾森氏菌的adhE基因(與GenBank登錄號NC_006155.1; g1: 51596429的序列中的核苷酸號2478099-2480774互補的核苷酸號);來自Pantoea ananatis的adhE基因(SEQ ID NO:29);來自植物乳桿菌的adhE基因(UniProtKB Entry: Q88RY9_LACPL);來自乳酸乳球菌 MG1363 的 adhE 基因(EMBL 登錄號AJ001007);等等(見圖2)。來自大腸桿菌的adhE基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:1表示。由這種adhE基因編碼的氨基酸序列由SEQ ID N0:2表示。[0063]因此，能夠使用基于來自大腸桿菌染色體的基因的已知核苷酸序列制備的引物通過 PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)；參見 White, T.J.等.，Trends Genet.，5，185 (1989))獲得 adhE基因。編碼來自其它微生物的醇脫氫酶的基因能夠以類似的方式獲得。[0064]用編碼以下的蛋白質(zhì)(A)或(B)的DNA作為源自大腸桿菌的adhE基因的示例:[0065](A)具有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0066](B) SEQ ID NO: 2中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0067]用編碼以下的蛋白質(zhì)(A)或⑶的DNA作為源自Pantoea ananatis的adhE基因的示例:[0068](A)具有SEQ ID NO:30中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0069](B) SEQ ID NO: 30中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0070]用編碼以下的蛋白質(zhì)(A)或(B)的DNA作為源自弗氏志賀氏菌的adhE基因的示例:[0071](A)具有SEQ ID NO:53中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0072](B)SEQ ID NO: 53中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0073]用編碼以下的蛋白質(zhì)㈧或(B)的DNA作為源自鼠疫耶爾森氏菌的adhE基因的示例:[0074](A)具有SEQ ID NO:54中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0075](B) SEQ ID N0:54中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0076]用編碼以下的蛋白質(zhì)㈧或⑶的DNA作為源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的adhE基因的示例:[0077](A)具有SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0078](B)SEQ ID NO: 55中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0079]用編碼以下 的蛋白質(zhì)(A)或⑶的DNA作為源自鼠傷寒沙門氏菌的adhE基因的示例:[0080](A)具有SEQ ID NO:56中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0081](B)SEQ ID NO: 56中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0082]用編碼以下的蛋白質(zhì)㈧或⑶的DNA作為源自植物乳桿菌的adhE基因的示例:[0083](A)具有SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0084](B)SEQ ID NO: 57中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0085]用編碼以下的蛋白質(zhì)(A)或⑶的DNA作為源自乳酸乳球菌的adhE基因的示例:[0086](A)具有SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或[0087](B)SEQ ID NO: 58中所示氨基酸序列的變體蛋白，該變體蛋白具有醇脫氫酶活性。[0088]短語“變體蛋白”如用于本發(fā)明中意思是序列中具有變化的蛋白質(zhì)，無論這些變化是氨基酸的缺失、插入、添加或取代，但是所述蛋白質(zhì)仍保留可用水平的醇脫氫酶活性。變體蛋白中變化的數(shù)量依賴于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的類型。相對于蛋白質(zhì)(A)而言，變化的數(shù)量可為1-30，優(yōu)選1-15，和更優(yōu)選1-5。變體中的這些變化是保留蛋白質(zhì)功能的保守突變。換句話說，這些變化可以發(fā)生在對于蛋白質(zhì)功能而言非關(guān)鍵性的蛋白質(zhì)區(qū)域中。這是因為一些氨基酸彼此具有高同源性，所以這樣的變化不影響三維結(jié)構(gòu)或活性。因此，只要保持醇脫氫酶活性，蛋白質(zhì)變體(B)可以是一種與SEQ ID N0.2中所示醇脫氫酶的完整氨基酸序列具有不少于70%,優(yōu)選不少于80%,更優(yōu)選不少于90%,并最優(yōu)選不少于95%同一性的蛋白質(zhì)變體。[0089]兩個氨基酸序列之間的同源性能夠使用公知的方法來測定，例如，計算以下三種參數(shù)的計算機程序BLAST2.0:得分、同一性和相似性。[0090]一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加應(yīng)為保守突變，從而保持活性。代表性保守突變是保守取代。保守取代的實例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gin、His或Lys 取代 Arg,用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn,用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp,用 Ser 或Ala 取代 Cys,用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln,用 Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu,用 Pro 取代 Gly,用 Asn、Lys> Gin、Arg 或 Tyr 取代 His,用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 He,用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu,用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys,用 lie、Leu、Val或 Phe 取代 Met,用 Trp> Tyr> Met、Ile 或 Leu 取代 Phe,用 Thr 或 Ala 取代 Ser,用 Ser 或Ala取代Thr,用Phe或Tyr取代Trp,用His、Phe或Trp取代Tyr,和用Met、Ile或Leu取代 Val。[0091]對來自大腸桿菌、弗氏志賀氏菌、Pantoea ananatis、鼠疫耶爾森氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、鼠傷寒沙門氏菌(革蘭氏陰性細菌)和植物乳桿菌、乳酸乳球菌(革蘭氏陽性細菌)的醇脫氫酶的基本序列(primary sequence)進行比較的數(shù)據(jù)顯示這些蛋白之間高水平的同源性(參見圖2)。從這個觀點，取代或缺失在全部上述蛋白中都相同的氨基酸殘基(用星號標記)對于這些蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。用相似的氨基酸殘基替代相似的(用冒號標記的)氨基酸殘基而無損于蛋白質(zhì)活性是可能的。但是對其它非保守氨基酸殘基的修飾可能不導致醇脫氫酶活性的改變。[0092]可以獲得編碼與上述醇脫氫酶基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA，例如，通過修飾編碼醇脫氫酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，例如通過定點誘變的方式，從而缺失、取代、插入或添加負責特定位點的一個或多個氨基酸殘基的核苷酸序列。如上所述修飾的DNA可以通過常規(guī)已知的突變處理獲得。 這些處理包括以羥胺處理編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA，或用UV照射或試劑如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理含有所述DNA的細菌。[0093]編碼與醇脫氫酶基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可通過在適當?shù)募毎斜磉_具有如上所述突變的DNA并研究任何表達產(chǎn)物的活性來獲得。編碼與醇脫氫酶基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA也可以通過如下獲得:分離能夠在嚴緊條件下與探針雜交并且編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA,所述探針具有核苷酸序列，該序列包含例如如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本文所提及的“嚴緊條件”是這樣的條件，在該條件下形成所謂的特異性雜合體，并且不形成非特異性雜合體。例如，可以以一些條件作為嚴緊條件的示例，在所述這些條件下，具有高同源性的DNA，例如具有不低于50%，優(yōu)選不低于60%，更優(yōu)選不低于70%，還更優(yōu)選不低于80%，進一步優(yōu)選不低于90%，最優(yōu)選不低于95%的同源性的DNA能夠相互雜交；但是具有低于上述同源性的DNA不能相互雜交?？蛇x地，可以以一些條件作為嚴緊條件的示例，在所述這些條件下，DNA能夠在下述鹽濃度下雜交，該鹽濃度等同于Southern雜交中通常的洗滌條件，即lxSSC，0.1%SDS，優(yōu)選0.lxSSC,0.1%SDS，在60°C。洗滌的持續(xù)時間依賴于用于印跡的膜的類型，并且通常由制造商推薦。例如，在嚴緊條件下對于Hybond N+尼龍膜(Amersham)推薦的洗滌持續(xù)時間是I 5分鐘。優(yōu)選地，可以進行2至3次洗滌。[0094]也可以將SEQ ID NO:1的核苷酸序列的部分序列用作探針?？梢允褂没赟EQ IDNO:1的核苷酸序列的引物，并使用含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA片段作為模板通過PCR制備探針。當使用長度約300 bp的DNA片段作為探針時，用于洗滌的雜交條件包括，例如，50。C，2xSSC 和 0.1%SDSο[0095]如上所述的核苷酸的取代、缺失、插入或添加也包括天然存在的突變(突變體或變體)，例如，由于細菌的種或者屬的多樣性而天然存在的突變，并且所述細菌含有醇脫氫酶(,and which contains alcohol dehydrogenase)。[0096]野生型醇脫氫酶可能受到金屬催化的氧化。盡管可以使用這樣的野生型醇脫氫酶，但是對有氧失活有抗性的突變醇脫氫酶在本發(fā)明中是優(yōu)選的。短語“對有氧失活有抗性的突變醇脫氫酶”的意思是在有氧條件下保持其活性的突變醇脫氫酶，或與野生型醇脫氫酶相比活性降低的量可忽略的突變醇脫氫酶。[0097]在大腸桿菌adhE基因的情況下，野生型醇脫氫酶包含SEQ ID NO: 2中所列的氨基酸序列。SEQ ID N0:2的醇脫氫酶中導致該蛋白質(zhì)對有氧失活有抗性的突變的實例是用賴氨酸殘基替代位置568處的谷氨酸殘基。然而，向adhE基因中引入突變(例如在SEQ IDNO: 2中的位置568處)可能導致在含有乙醇作為碳源的液體培養(yǎng)基中的生長延緩，在這樣的情況下，優(yōu)選的是突變醇脫氫酶具有能夠改進細菌在含有乙醇作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中的生長的至少一個額外突變。例如，當用另一種氨基酸殘基替代SEQ ID N0:2的醇脫氫酶中位置568處的谷氨酸殘基時，通過引入選自下組的額外突變，改進了大腸桿菌的生長:[0098]A)用另一種氨基酸殘基，例如賴氨酸殘基，替代SEQ ID NO: 2中在位置560的谷氨酸殘基；[0099]B)用另一種氨基酸殘基，例如纈氨酸殘基，替代SEQ ID NO: 2中在位置560的谷氨酸殘基；[0100]C)用其它氨基酸殘基，例如分別用甘氨酸殘基、纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基和纈氨酸殘基，替代SEQ ID勵:2中分別在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、 異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和[0101]D)以上各項的組合。[0102]涉及的序列中的位置號，例如，短語“在位置22、236、554、560、566和786的氨基酸殘基”是指在來自大腸桿菌的野生型AdhE的氨基酸序列中這些殘基的位置。然而，氨基酸殘基的位置可能變化。例如，如果在N-末端部分插入一個氨基酸殘基，那么原本位于位置22的氨基酸殘基則變成在位置23。在這樣的情況下，在原位置22的氨基酸殘基是本發(fā)明的在位置22的氨基酸殘基。[0103]突變AdhE可以在除上面A)-C)中確定的位置之外的一個或多個位置包括一個或幾個氨基酸的缺失、取代、插入或添加，條件是不喪失或降低AdhE活性。[0104]根據(jù)本發(fā)明的突變AdhE和突變adhE基因能夠從野生型adhE基因獲得，例如，通過使用常規(guī)方法的位點特異性誘變，所述常規(guī)方法如PCR (聚合酶鏈式反應(yīng)，參見White，T.J.等.，Trends Genet.，5，185(1989)),其利用基于所述基因的核苷酸序列制備的引物。[0105]野生型大腸桿菌中adhE基因的轉(zhuǎn)錄僅在厭氧條件下被誘導，主要是響應(yīng)于還原的 NADH 水平提高(Leonardo, M.R., Cunningham, P.R.&Clark, D.P., J.Bacteriol.175870-878(1993))。[0106]在本發(fā)明中，修飾用于產(chǎn)生L-氨基酸的細菌菌株，從而使adhE基因的表達由非天然啟動子調(diào)控，即，在野生型菌株中不調(diào)控adhE基因表達的啟動子。這樣的修飾可以通過用在有氧培養(yǎng)條件下有功能的非天然啟動子替代染色體上adhE基因的天然啟動子從而使adhE基因與該非天然啟動子可操作地連接來實現(xiàn)。作為在有氧培養(yǎng)條件下有功能的非天然啟動子，可以使用在有氧培養(yǎng)條件下能夠使adhE基因的表達在特定水平之上的任何啟動子。關(guān)于本發(fā)明中AdhE蛋白的水平，根據(jù)Clark和Cronan(J.Bacteriol.141177-183(1980))的方法測量的無細胞提取物中醇脫氫酶的活性應(yīng)為每mg蛋白質(zhì)1.5個單位或更多，優(yōu)選5個單位或更多，并且更優(yōu)選10個單位或更多。有氧培養(yǎng)條件可以是那些通常用于培養(yǎng)細菌的條件，其中通過如振搖、通氣和攪拌等方法來提供氧氣。具體而言，可以使用已知在有氧培養(yǎng)條件下表達基因的任何啟動子。例如，可以使用糖酵解(glycosis)、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)、氨基酸生物合成途徑等中涉及的基因的啟動子。此夕卜，λ噬菌體的Pta。啟動子、Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、Pk或Plj啟動子全部已知為在有氧培養(yǎng)條件下有功能的強啟動子，并且是優(yōu)選使用的。[0107]可以將非天然啟動子的使用與基因拷貝的倍增(multiplication)組合。例如，將與非天然啟動子可操作地連接的adhE基因插入能夠在腸桿菌科細菌中發(fā)揮功能的載體，并將該載體引入細菌，這使得細胞中所述基因的拷貝數(shù)增加。優(yōu)選地，使用低拷貝載體。低拷貝載體的實例包括，但不限于，PSC101、P麗118、P麗119等。術(shù)語“低拷貝載體”用于拷貝數(shù)為多至5個拷貝每細胞的載體。增加adhE基因的拷貝數(shù)也可以通過如下來實現(xiàn):通過例如同源重組、Mu整合等將該基因的多個拷貝引入細菌的染色體DNA。同源重組使用以多個拷貝存在的序列作為染色體DNA上的靶來進行。在染色體DNA上具有多個拷貝的序列包括，但不限于，重復DNA，或存在于轉(zhuǎn)座元件末端的反向重復序列。同樣，如美國專利N0.5，595, 889中公開的，可以將adhE基因并入轉(zhuǎn)座子，再使其轉(zhuǎn)移以將該基因的多個拷貝引入染色體DNA。在這些情況下，可以將adhE基因置于在有氧培養(yǎng)條件下有功能的啟動子的調(diào)控之下?？蛇x地，可以通過例如向該啟動子中引入突變以增加位于該啟動子下游的基因的轉(zhuǎn)錄水平來增強啟動子的作用。 另外，已知對于在核糖體結(jié)合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中的幾個核苷酸的取代，特別是在起始密碼子緊鄰上游的序列中的幾個核苷酸的取代，顯著影響mRNA的可翻譯性(translatability)。例如，依賴于起始密碼子之前的三個核苷酸的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了 20倍范圍的表達水平(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981 ；Hui 等，EMBO J.，3，623-629，1984)。之前，顯示了 rhtA23突變是在相對于ATG起始密碼子的_1位置的A對G的取代(A_for_Gsubstitution) (ABSTRACTS of17th International Congress of Biochemistry andMolecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the AmericanSocietyfor Biochemistry and Molecular Biology (第 17 屆國際生物化學與分子生物學大會暨美國生物化學與分子生物學學會1997年年會摘要)，San Francisco, CaliforniaAugust24-29, 1997, abstract N0.457)。因此,可以想到 rhtA23 突變增強 rhtA 基因表達,并因此增加對蘇氨酸、高絲氨酸和轉(zhuǎn)運到細胞外的一些其它物質(zhì)的抗性。[0108]另外，還可以將核苷酸取代引入細菌染色體上adhE基因的啟動子區(qū)，其產(chǎn)生更強的啟動子功能?？梢赃M行表達調(diào)控序列的改變，例如，使用溫度敏感質(zhì)粒按照與基因取代相同的方式進行，如國際專利公開W000/18935和日本專利申請公開號1-215280。[0109]在本發(fā)明中，“產(chǎn)生L-氨基酸的細菌”的意思是當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細菌時，具有產(chǎn)生L-氨基酸并將L-氨基酸分泌到培養(yǎng)基中的能力的細菌?？梢酝ㄟ^培育來賦予或增強產(chǎn)生L-氨基酸的能力。本文使用的術(shù)語“產(chǎn)生L-氨基酸的細菌”也表示能夠產(chǎn)生L-氨基酸并且引起L-氨基酸以大于該細菌(例如，大腸桿菌，如大腸桿菌K-12)的野生型或親本菌株的量在培養(yǎng)基中積累的細菌，并且優(yōu)選地表示能夠在培養(yǎng)基中引起不少于0.5g/L，更優(yōu)選不少于1.0g/L的量的目標L-氨基酸積累的細菌。術(shù)語“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸是特別優(yōu)選的。[0110]腸桿菌科包括屬于以下屬的細菌:埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、摩根氏菌屬、耶爾森氏菌屬等。具體而言，可以使用根據(jù)NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information ;國家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫使用的分類學(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi id=91347)歸類于腸桿菌科的那些。屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細菌是優(yōu)選的。短語“屬于埃希氏菌屬的細菌”的意思是根據(jù)微生物領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法歸類于埃希氏菌屬的細菌。如在本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的細菌的實例包括，但不限于大腸桿菌(E.coli)。[0111]對于能夠用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的細菌無具體限制，然而，例如，Neidhardt, F.C.等.(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Societyfor Microbiology, Washington D.C., 1208,表I)描述的細菌包括在本發(fā)明內(nèi)。[0112]屬于泛菌屬的細菌的意思是根據(jù)微生物領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法歸類于泛菌屬的細菌。最近已經(jīng)將成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)的一些種基于16S rRNA的核苷酸序列分析等重新歸類于成團泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis (菠蘿泛菌)、 斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等(Int.J.Syst.Bacteriol.，43，162-173(1993))。[0113]本發(fā)明的細菌包括這樣的腸桿菌科的菌株，該菌株具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并且已經(jīng)經(jīng)過修飾從而使編碼醇脫氫酶的基因在啟動子的調(diào)控下表達，所述啟動子在有氧培養(yǎng)條件下有功能。此外，本發(fā)明的細菌包括這樣的腸桿菌科的菌株，該菌株具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并且沒有天然的醇脫氫酶活性，但是已經(jīng)用編碼醇脫氫酶的DNA片段轉(zhuǎn)化。[0114]在本發(fā)明中，由于編碼醇脫氫酶的基因在處于有氧培養(yǎng)條件下時有功能的啟動子的控制下表達，所以在含有乙醇作為碳源的培養(yǎng)基中積累的L-氨基酸的量能夠顯著增加，所述L-氨基酸例如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸。[0115]產(chǎn)生L-氨基酸的細菌[0116]作為被修飾而具有本發(fā)明的突變醇脫氫酶的本發(fā)明的細菌，可以使用能夠產(chǎn)生芳族或非芳族L-氨基酸的細菌。[0117]可以通過將編碼本發(fā)明的突變醇脫氫酶的基因引入天然具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細菌來獲得本發(fā)明的細菌?；蛘撸梢酝ㄟ^將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予已經(jīng)具有突變醇脫氫酶的細菌來獲得本發(fā)明的細菌。[0118]產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌[0119]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌的親本菌株實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國專利N0.5，175，107，美國專利 N0.5，705，371)、大腸桿菌 472T23/pYN7 (ATCC98081)(美國專利 N0.5，631，157)、大腸桿菌NRRL-21593 (美國專利N0.5，939，307)、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國專利N0.5，474，918)、大腸桿菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美國專利 N0.5，376，538)、大腸桿菌 MG442 (Gusyatiner 等，Genetika (俄語)，14，947-956 (1978))、大腸桿菌 VL643 和VL2055 (EPl 149911A)等。[0120]菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，也是鹿糖同化性的(sucrose-assimilative),并且此菌株中的ilvA基因具有滲漏突變(leaky mutation)。這種菌株還在rhtA基因中具有突變，該突變賦予對高濃度的蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。菌株B-3996含有質(zhì)粒PVIC40，其通過將包括突變thrA基因的thrA*BC操縱子插入由RSF1010衍生的載體而獲得。這種突變thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其具有基本上脫敏的蘇氨酸反饋抑制。菌株 B-3996(大腸桿菌(Escherichia coli) TJI Γ 6/pVIC40)于 1987 年 11 月 19 日以登錄號 RIA1867 保藏在 All-Union Scientific Center of Antibiotics (全聯(lián)盟抗生素科學中心)(Russia, 117105Moscow, Nagatinskaya Street3~A)。該菌株還于 1987 年 4 月 7 日以登錄號VKPM B-3996保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia, 117545Moscow, IDorozhny proezd,.1)。[0121]大腸桿菌VKPM B-5318(EP0593792B)也可以用作親本菌株來得到本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌。菌株B-5318相對于異亮氨酸是原養(yǎng)型的，溫度敏感λ噬菌體Cl阻抑物和Pk啟動子替代了該菌株含有的質(zhì)粒PVIC40中的蘇氨酸操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)。菌株VKPMΒ-5318在1990年5月3日以登錄號VKPM Β-5318保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) ο[0122]優(yōu)選地， 額外地修飾本發(fā)明的細菌以增強以下基因中一個或多個的表達:[0123]-突變thrA基因，其編碼對蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶I ;[0124]-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；[0125]-thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶；[0126]-rhtA基因，其編碼推定的跨膜蛋白；[0127]_asd基因，其編碼天冬氨酸-β -半醛脫氫酶；和[0128]-aspC基因，其編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)；[0129]編碼大腸桿菌的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因已經(jīng)闡明(GenBank登錄號NC_000913.2，g1:49175990的核苷酸位置337-2799)。thrA基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrL和thrB基因之間。編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)闡明(GenBank 登錄號 NC_000913.2，g1:49175990 的核苷酸位置 2801-3733)。thrB 基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrA和thrC基因之間。編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thrC基因已經(jīng)闡明(GenBank 登錄號 NC_000913.2，g1:49175990 的核苷酸位置 3734-5020)。thrC 基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrB基因和yaaX開讀框之間。所有三個基因起單一的蘇氨酸操縱子的作用。為了增強蘇氨酸操縱子的表達，理想的是將影響轉(zhuǎn)錄的弱化子區(qū)域從該操縱子中去除(W02005/049808、W02003/097839)。[0130]編碼對蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因，連同thrB和thrC基因，能夠作為一個操縱子從已知質(zhì)粒pVIC40獲得，該質(zhì)粒存在于產(chǎn)生蘇氨酸的大腸桿菌菌株VKPM B-3996中。質(zhì)粒pVIC40在美國專利N0.5，705，371中詳細描述。[0131]rhtA基因位于大腸桿菌染色體上的18分鐘處，接近glnHPQ操縱子，glnHPQ操縱子編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的組分。rhtA基因與0RFl(ybiF基因，核苷酸位置764-1651，GenBank登錄號AAA218541，g1:440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之間。已經(jīng)將表達由ORFl編碼的蛋白的DNA序列定名為rhtA基因(rht:對高絲氨酸和蘇氨酸的抗性)。同樣，已知rhtA23突變是在相對于ATG起始密碼子而言的位置-1處A對G的取代(ABSTRACTSof thel7th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology inconjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry andMolecular Biology (第17屆國際生物化學與分子生物學大會暨美國生物化學與分子生物學學會 1997 年年會摘要)，San Francisco, California August24_29, 1997, abstractN0.457，EP1013765A)。在下文中，將 rhtA23 突變標記為 rhtA*。[0132]大腸桿菌的asd基因已經(jīng)闡明(核苷酸位置3572511-3571408，GenBank登錄號NC_000913.l，g1:16131307),并且能夠利用基于該基因的核苷酸序列制備的引物通過PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)；參見White, T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))獲得。其它微生物的asd基因能夠以相似的方式獲得。[0133]同樣，大腸桿菌的aspC基因已經(jīng)闡明(核苷酸位置983742-984932，GenBank登錄號NC_000913.l，g1:16128895),并且能夠通過PCR獲得。其它微生物的aspC基因能夠以相似的方式獲得。[0134]產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌[0135]屬于埃希 氏菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌的實例包括對L-賴氨酸類似物具有抗性的突變體。L-賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細菌的生長，但是當培養(yǎng)基中存在L-賴氨酸時,這種抑制全部或部分地脫敏。L-賴氨酸類似物的實例包括,但不限于,氧代賴氨酸(oxalysine)、賴氨酸氧廂酸(lysine hydroxamate)、S_ (2_氨基乙基)_L_半胱氨酸(AEC)、Y -甲基賴氨酸、α-氯代己內(nèi)酰胺(a-chlorocaprolactam)等。對這些賴氨酸類似物具有抗性的突變體能夠通過對屬于埃希氏菌屬的細菌進行常規(guī)人工誘變處理來獲得。可用于產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌菌株的具體實例包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543, NRRL8-12185;參見美國專利如.4，346，170)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，天冬氨酸激酶的L-賴氨酸反饋抑制是脫敏的。[0136]可以使用菌株WC196作為產(chǎn)生L-賴氨酸的大腸桿菌細菌。這種細菌菌株是通過將AEC抗性賦予源自大腸桿菌K-12的菌株W3110來培育的。將所得菌株命名為大腸桿菌AJ13069 (Escherichia coli AJ13069)，并且在1994年12月6日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)研究院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(現(xiàn)在稱作獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary),Tsukuba Central6, 1-1, Higashil-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，Japan),并且獲得了登錄號FERM P-14690。之后根據(jù)布達佩斯條約規(guī)定在1995年9月29日將其轉(zhuǎn)為國際保藏，并且獲得了登錄號FERM BP-5252(美國專利N0.5，827，698)。[0137]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括這樣的菌株，在這些菌株中將編碼L-賴氨酸生物合成酶的一個或多個基因的表達增強。這些基因的實例包括，但不限于，編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因(dapA)、編碼天冬氨酸激酶的基因(IysC)、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的基因(dapB)、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的基因(IysA)、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因(ddh)(美國專利N0.6，040, 160)、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(PPC)、編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因(asd)和編碼天冬氨酸酶的基因(aspA) (EP1253195A)。另外，親本菌株可以具有表達水平增加的涉及能效(energyefficiency)的基因(cyo) (EP1170376A)、編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(pntAB)(美國專利 N0.5，830，716)、ybjE 基因(W02005/073390)或它們的組合。[0138]用于得到本發(fā)明的產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括這樣的菌株，其具有活性降低或消除的酶，該酶催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支(branch off)而產(chǎn)生L-賴氨酸之外化合物的反應(yīng)。催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸之外化合物的反應(yīng)的酶的實例包括高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國專利N0.5，827，698)和蘋果酸酶(malic enzyme) (W02005/010175)。[0139]產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株的實例包括大腸桿菌WC196AcadAAldc/pCABD2 (W02006/078039)，這種菌株通過向菌株WC196中弓丨入質(zhì)粒pCABD2 (其在美國專利N0.6，040, 160中公開)獲得，菌株WC196具有破壞的編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和IdcC基因。質(zhì)粒pCABD2含有:具有突變的編碼二氫吡啶二羧酸合酶的大腸桿菌dapA基因，所述突變使L-賴氨酸反饋抑制脫敏；具有突變的編碼天冬氨酸激酶III的大腸桿菌IysC基因，所述突變使L-賴氨酸的反饋抑制脫敏；編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的大腸桿菌dapB基因；和編碼二氨基庚二酸脫氫酶的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ddh基因。[0140]產(chǎn)生L-半胱氨酸的細菌[0141]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-半胱氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如用編碼反饋抗性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的不同cysE等位基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM15(美國專利N0.6，218，168，俄羅斯專利申請2003121601);使編碼蛋白質(zhì)的基因過表達的大腸桿菌W3110，所述蛋白質(zhì)適于分泌對細胞有毒的物質(zhì)(美國專利N0.5，972，663);半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(JP11155571A2);由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控物(positivetranscription regulator)活性增加的大腸桿菌 W3110 菌株(W00127307A1),等等。[0142]產(chǎn)生L-亮氨酸的細菌[0143]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-亮氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如對亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美國專利N0.6，124，121))或?qū)α涟彼犷愃莆?包括β _2_噻吩丙氨酸(β -2-thienylalanine)、3_輕基亮氨酸、4-氮雜亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸)有抗性的大腸桿菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A);通過遺傳工程方法獲得的大腸桿菌菌株如W096/06926中描述的那些；大腸桿菌H-9068 (JP8-70879A)，等等。[0144]可以通過增強L-亮氨酸生物合成中涉及的一個或多個基因的表達來改進本發(fā)明的細菌。實例包括IeuABCD操縱子中的基因，這些基因優(yōu)選的代表是突變IeuA基因，該基因編碼不受L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶(美國專利6，403，342)。此外，可以通過增強編碼從細菌細胞分泌L-氨基酸的蛋白的一個或多個基因的表達來改進本發(fā)明的細菌。這些基因的實例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。[0145]產(chǎn)生L-組氨酸的細菌[0146]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-組氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌24菌株(VKPM B-5945, RU2003677);大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270, RU2119536);大腸桿菌 NRRL B-12116-B12121 (美國專利 N0.4，388，405)；大腸桿菌 H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美國專利 N0.6，344，347)；大腸桿菌 H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087);大腸桿菌 AI80/pFM201 (美國專利N0.6，258，554)等等。[0147]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-組氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括如下菌株，所述菌株中編碼L-組氨酸生物合成酶的一個或多個基因的表達增強。這些基因的實例包括編碼下述酶的基因=ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP環(huán)化水解酶(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亞氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸異構(gòu)酶(phosphoribosyl formimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotideisomerase) (hisA)、酰胺轉(zhuǎn)移酶(hisH)、組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(hisC)、組氨醇磷酸酶(hisB)、組氨醇脫氫酶(hisD)等。[0148]已知由hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成酶被L-組氨酸所抑制，因此還可以通過將突變引入任何這些基因中以將對反饋抑制的抗性賦予由這些基因編碼的酶，從而有效地增強產(chǎn)生L-組氨酸的能力(俄羅斯專利Nos.2003677和2119536)。[0149]具有產(chǎn)生L-組氨酸能力的菌株具體實例包括:大腸桿菌FERM P-5038和5048，其已經(jīng)用攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化(JP 56-005099A);用rht (即氨基酸輸出蛋白的基因)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株(EP1016710A);賦予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素-抗性的大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270，俄羅斯專利N0.2119536)，等等 ο[0150]產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌[0151]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌VL334thrC+ (EPl 172433)。大腸桿菌VL334 (VKPM B-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突變(美國專利N0.4，278，765)。利用生長于野生型大腸桿菌菌株K12 (VKPM B-7)細胞上的噬菌體P1，用常規(guī)轉(zhuǎn)導來轉(zhuǎn)移thrC基因的野生型等位基因。結(jié)果，獲得了能夠產(chǎn)生L-谷氨酸的L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。[0152]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，α -酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的菌株，或其中編碼L-谷氨酸生物合成酶的一個或多個基因的表達增強的菌株。這些基因的實例包括編碼谷氨酸脫氫酶的基因(gdh)、編碼谷氨酰胺合成酶的基因(glnA)、編碼谷氨酸合成酶的基因(gltAB)、編碼異檸檬酸脫氫酶的基因(icdA)、編碼烏頭酸水合酶的基因(acnA、acnB)、編碼朽1檬酸合酶(citrate synthase)的基因(gltA)、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(ppc)、編碼丙酮酸脫氫酶的基因(aceEF、IpdA)、編碼丙酮酸激酶的基因(pykA、pykF)、編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的基因(ppsA)、編碼烯醇化酶的基因(eno)、編碼磷酸甘油酸變位酶的基因(pgmA、pgml)、編碼磷酸甘油酸激酶的基因(Pgk)、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因(gapA)、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因(tpiA)、編碼果糖二磷酸醛縮酶的基因(fbp)、編碼磷酸果糖激酶的基因(pfkA，pfkB)、編碼葡糖磷酸異構(gòu)酶的基因(Pgi)等。[0153]經(jīng)修飾以使朽1檬酸合成酶(citrate synthetase)基因和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的表達降低的，和/或α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的菌株的實例包括在ΕΡ1078989Α、ΕΡ955368Α 和 ΕΡ952221Α 中公開的那些菌株。[0154]用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括將下述酶的活性減少或去除的菌株，所述酶催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支的除L-谷氨酸外的化合物的合成。這些酶的實例包括異檸檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脫氫酶(sucA)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰輕酸合酶(acetohydorxy acid synthase) (ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Pfl)、乳酸脫氫酶(Idh)、和谷氨酸脫羧酶(gadAB)。在美國專利Nos.5，378，616和5，573，945中描述了 α -酮戊二酸脫氫酶活性缺失或降低的屬于埃希氏菌屬的細菌及獲得它們的方法。具體地，這些菌株包括下面的:[0155]大腸桿菌W 31 IOsucA::KmE[0156]大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)[0157]大腸桿菌AJ12628(FERM BP-3854)[0158]大腸桿菌AJ12949(FERM BP-4881)[0159]通過破壞大腸桿菌W3110的α -酮戊二酸脫氫酶基因(在下文稱為“sucA基因”)來獲得大腸桿菌W3110suCA::KmK。該菌株完全缺失α-酮戊二酸脫氫酶活性。[0160]產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌的其它實例包括屬于埃希氏菌屬并且對天冬氨酸抗代謝物具有抗性的細菌。這些菌株也可能是α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的，包括例如大腸桿菌AJ13199 (FERMBP-5807)(美國專利N0.5.908, 768)，額外具有低L-谷氨酸分解能力的 FERM P-12379 菌株(美國專利 N0.5，393，671) ；AJ13138 (FERM BP-5565)(美國專利N0.6，110，714)，等等。[0161]產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌的實例包括α-酮戊二酸脫氫酶活性缺失或α-酮戊二酸脫氫酶活性降低的屬于泛菌屬(genus Pantoea)的突變菌株，并且可以如上所述獲得。這些菌株包括 Pantoea ananatis AJ13356 (美國專利 N0.6，331，419)。Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在稱作獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心，Central6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，Japan)，登錄號為 FERM P-16645。其后按照布達佩斯條約的規(guī)定，在1999年I月11日將其轉(zhuǎn)為國際保藏，并得到登錄號FERM BP-6615。作為破壞ct KGDH-EI亞基基因(sucA)的結(jié)果，Pantoea ananatis AJ13356的麗戍二酸脫氫酶活性缺失。當將上述菌株分離時將其鑒定為成團腸桿菌，并且作為成團腸桿菌AJ13356保藏。但是，近來基于對16SrRNA的核苷酸測序等，將其重新歸類為Pantoeaananatis。盡管AJ13356作為成團腸桿菌保藏在前述保藏單位，就本說明書而言，將它們描述為 Pantoea ananatis。[0162]產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細菌[0163]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌4112739&7^::1'111037成)(￥1^1 B-8197);具有突變pheA34基因的大腸桿菌HW1089 (ATCC55371)(美國專利N0.5，354，672);大腸桿菌 MWEClOl-b(KR8903681);大腸桿菌 NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146 和NRRL B-12147 (美國專利 N0.4，407，952)。同樣地，可使用大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)，大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)，大腸桿菌K-12 [W3110 (tyrA) /pPHATerm] (FERM BP-12662)和命名為 AJ12604 (FERM BP-3579)的大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB]作為親本菌株(EP488424B1)。此外，還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白活性增強的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的屬于埃希氏菌屬的細菌(美國專利申請 2003/0148473A1 和 2003/0157667 Al)。[0164]產(chǎn)生L-色氨酸的細菌[0165]能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-色氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌JP4735/pMU 3028(DSM10122)和JP6015/PMU 91(DSM10123)，其由突變trpS基因編碼的色氨酰-tRNA合成酶缺陷(美國專利N0.5，756，345);大腸桿菌SV164 (pGH5)，其具有編碼不受絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼不受色氨酸反饋抑制性的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美國專利6，180, 373);色氨酸酶缺陷的大腸桿菌 AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美國專利N0.4，371，614);產(chǎn)生磷酸烯醇丙酮酸的能力增強的大腸桿菌AGX17/pGX50, pACKG4-pps (W09708333,美國專利 N0.6，319，696)等等。還可以使用由 yedA 或yddG基因編碼的蛋白活性增強的產(chǎn)生L-色氨酸的屬于埃希氏菌屬的細菌(美國專利申請2003/0148473A1和 2003/0157667A1)。[0166] 能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-色氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括其中以下酶中一種或多種的活性增強的菌株:鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者均受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此可以向這些酶中引入使反饋抑制脫敏的突變。具有此類突變的菌株的具體實例包括具有脫敏的鄰氨基苯甲酸合酶的大腸桿菌SV164和通過將質(zhì)粒pGH5引入大腸桿菌SV164獲得的轉(zhuǎn)化菌株(W094/08031)，所述質(zhì)粒pGH5包含編碼反饋脫敏的磷酸甘油酸脫氫酶的突變serA基因。
能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-色氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括已經(jīng)用色氨酸操縱子轉(zhuǎn)化的菌株，所述色氨酸操縱子包含編碼脫敏的鄰氨基苯甲酸合酶的基因(JP57-71397A、JP62-244382A、美國專利N0.4，371，614)。此外，可以通過增強色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達來賦予產(chǎn)生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亞基組成，其分別由trpA和trpB基因編碼。另外，可以通過增強異檸檬酸裂合酶-蘋果酸合酶操縱子的表達來改進產(chǎn)生L-色氨酸的能力(W02005/103275)。
產(chǎn)生L-脯氨酸的細菌
能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-脯氨酸的細菌的親本菌株實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如ilvA基因缺陷并且能夠產(chǎn)生L-脯氨酸的大腸桿菌702ilvA(VKPMB-8012) (EPl 172433).可以通過增強L-脯氨酸生物合成中涉及的一個或多個基因的表達來改進本發(fā)明的細菌。這些基因的實例包括編碼對L-脯氨酸反饋抑制脫敏的谷氨酸激酶的proB基因(德國專利3127361)。此外，可以通過增強一個或多個編碼負責從細菌細胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表達來改進本發(fā)明的細菌。這些基因的例子是b2682和b2683基因(ygaZH 基因)(EP1239041A2)。
具有產(chǎn)生L-脯氨酸活性的屬于埃希氏菌屬的細菌的實例包括下列大腸桿菌菌株:NRRL B-12403 和 NRRL B-12404 (英國專利 2075056)，VKPM B-8012 (俄羅斯專利申請2000124295)，德國專利3127361中描述的質(zhì)粒突變體，Bloom F.R.等描述的質(zhì)粒突變體(The15th Miami winter symposium(第15界邁阿密冬季研討會)，1983，第34頁)等等。
產(chǎn)生L-精氨酸的細菌
能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-精氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌237菌株(VKPM B-7925)(美國專利申請2002/058315A1)及其帶有突變的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄羅斯專利申請 N0.2001112869)，大腸桿菌 382 菌株(VKPM B-7926) (EPl 170358A1)，用編碼 N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生精氨酸的菌株(EP1170361A1)，等等。
能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-精氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括編碼L-精氨酸生物合成酶的一個或多個基因的表達增強的菌株。這些基因的實例包括編碼N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶的基因(argC)、編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因(argj)、編碼N-乙酰谷氨酸激酶的基因(argB)、編碼乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因(argD)、編碼鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的基因(argF)、編碼精氨琥珀酸合成酶的基因(argG)、編碼精氨琥珀酸裂合酶的基因(argH)、編碼氨甲酰基磷酸合成酶的基因(carAB)等。
產(chǎn)生L-纈氨酸的細菌
能夠用于得到本發(fā)明 的產(chǎn)生L-纈氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，經(jīng)修飾以過表達ilvGMEDA操縱子的菌株(美國專利N0.5，998，178)。理想的是將負責衰減的ilvGMEDA操縱子的區(qū)域移除以使產(chǎn)生的L-纈氨酸不會削弱該操縱子的表達。此外，理想的是將操縱子中的ilvA基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。
能夠用于得到本發(fā)明的產(chǎn)生L -纈氨酸的細菌的親本菌株的實例還包括氨酰t-RNA合成酶的突變體(美國專利N0.5，658，766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970，該菌株在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。已將大腸桿菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (Russia, 117545Moscow, IDorozhnyProezd, I)，登錄號為 VKPM B-4411。
此外,還可以使用生長需要硫辛酸(lipoic acid)的突變體和/或缺乏H+-ATP酶的突變體作為親本菌株(W096/06926)。
產(chǎn)生L-異亮氨酸的細菌
能夠用于得到本發(fā)明產(chǎn)生L-異亮氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，對6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變體(JP5-304969A)，對異亮氨酸類似物如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧I虧酸具有抗性的突變體，以及額外對DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變體(JP5-130882A)。此外，還可以使用以編碼L-異亮氨酸生物合成中涉及的蛋白(如蘇氨酸脫氨酶和乙酰羥酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因轉(zhuǎn)化的重組菌株(JP2-458 A, FR0356739和美國專利N0.5，998，178)作為親本菌株。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的L-氨基酸的方法包括以下步驟:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細菌，使L-氨基酸能夠在培養(yǎng)基中積累，和從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。此外，本發(fā)明的方法包括用于產(chǎn)生L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸的方法，包括以下步驟:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細菌，使L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸能夠在培養(yǎng)基中積累，和從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸。
在本發(fā)明中，從培養(yǎng)基培養(yǎng)、收集和純化L-氨基酸等可通過常規(guī)發(fā)酵方法進行，其中使用細菌來產(chǎn)生L-氨基酸。
培養(yǎng)基可以是合成的或天然的，只要該培養(yǎng)基包括碳源、氮源、礦質(zhì)，如有必要，還包括細菌生長所需的適量營養(yǎng)物。碳源可以包括多種糖，例如葡萄糖和蔗糖，多種有機酸和醇，如乙醇。根據(jù)本發(fā)明，可以使用乙醇作為唯一碳源或者與糖(如葡萄糖和蔗糖)混合。作為氮源，可以使用多種銨鹽如氨水和硫酸銨，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆-水解物和消化的發(fā)酵微生物。作為礦質(zhì)，可以使用磷酸氫二鉀(potassiummonophosphate)、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣等等。作為維生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等等。如有必要，可以向培養(yǎng)基添加額外的營養(yǎng)物。例如，如果細菌生長需要L-氨基酸(L-氨基酸營養(yǎng)缺陷型(L-amino acid auxotrophy)),可以向培養(yǎng)基添加足夠量的L-氨基酸。
培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件下進行，如搖動培養(yǎng)和帶有通氣的攪拌培養(yǎng)，溫度為20-40° C，優(yōu)選30-38° C。培養(yǎng)物的pH通常為5_9，優(yōu)選6.5-7.2?？梢杂冒彼?、碳酸鈣、多種酸、多種堿和緩沖劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。通常1-5天的培養(yǎng)導致目標氨基酸在液體培養(yǎng)基中的積累。
培養(yǎng)之后，可以通過離心或膜過濾將固體如細胞從液體培養(yǎng)基去除，然后可以收集目標L-氨基酸并通過離子交換、濃縮和/或結(jié)晶方法純化。
附圖簡述

圖1顯示大腸桿菌染色體中adhE基因上游區(qū)的結(jié)構(gòu)，以及含有cat基因和P^tac啟動子的整合DNA片段的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示來自以下菌種的醇脫氫酶的原始序列的比對:大腸桿菌(ADHE_ECOLI, SEQ ID NO:2),弗氏志賀氏菌(Q83RN2_SHIFL, SEQ ID NO:53)、Pantoeaananatis(ADHE PANAN, SEQ ID NO: 30)、鼠疫耶爾森氏菌(Q66AM7_YERPS, SEQ ID NO: 54)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Q6D4R4_ERWCT，SEQ ID NO: 55)、鼠傷寒沙門氏菌(P74880_SALTY, SEQID NO: 56)、植物乳桿菌(Q88RY9_LACPL, SEQ ID NO:57)和乳酸乳球菌(086282_9LACT，SEQID NO: 58)。所述比對使用PIR多重比對程序來進行(http://pir.georgetown.edu)。用星號(*)標記相同的氨基酸，用冒號(:)標記相似的氨基酸。
圖3顯示在含有乙醇(2%或3%)作為唯一碳源的M9基本培養(yǎng)基上生長的修飾菌株的生長曲線。
圖4顯示在含有葡萄糖(0.1重量％)和乙醇(0.1體積％)的混合物的M9基本培養(yǎng)基上生長的修飾菌株的生長曲線。
圖5顯示具有在天然啟動子或P1^ta。啟動子調(diào)控下的突變adhE*基因的菌株在含有乙醇(2%或3%)作為唯一碳源的M9基本培養(yǎng)基上生長的生長曲線的比較。
實施例
將參考以下非限定性實施例對本發(fā)明進行更具體的闡釋。
實施例1.制備大腸桿菌MG1655 Δ tdh, rhtA*
通過如下構(gòu)建產(chǎn)生L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG1655Atdh，rhtA*(pVIC40):使用cat基因?qū)⒋竽c桿菌MG1655(ATCC700926)中編碼蘇氨酸脫氫酶的天然tdh基因失活，其后引入rhtA23突變(rhtA*)，該突變賦予對高濃度的蘇氨酸(>40mg/ml)和高絲氨酸(>5mg/ml)的抗性。然后用來自大腸桿菌VKPM B-3996的質(zhì)粒pVIC40轉(zhuǎn)化所得菌株。質(zhì)粒pVIC40在美國專利N0.5，705, 371中詳細描述。
為了替代天然的 tdh 基因，用 Datsenko K.A.和 Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97，6640-6645)所述的也稱為 “Red 介導的整合(Red-mediatedintegration) ”和/或“Red-驅(qū)動的整合(Red-driven integration) ”的方法，將攜帶由 cat基因編碼的氯霉素抗性標記(CmK)的DNA片段整合到大腸桿菌MG1655的染色體中以替代天然基因。使用具有熱敏感的復制子的重組質(zhì)粒pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, 97，6640-6645)作為負責Red-介導的重組體系的由噬菌體λ得到的基因的供體。含有重組質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌BW25113可以從Ε.coli Genetic StockCenter, Yale University, New Haven, USA 獲得，其登錄號為 CGSC7630。
使用商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒pACYC184(GenBank/EMBL登錄號X06403, “Fermentas”，Lithuania)作為模板，以及引物 Pl (SEQ ID NO: 3)和 P2 (SEQ IDNO:4)通過PCR獲得了含有由cat基因編碼的CmK標記的DNA片段。引物Pl含有引入到該引物中的與tdh基因5’-區(qū)同源的35個核苷酸用于進一步整合到細菌染色體中。引物P2含有引入到該引物中的與tdh基因3’ -區(qū)同源的32個核苷酸用于進一步整合到細菌染色體中。
使用“Gene Amp PCR System2700” 擴增設(shè)備(Applied Biosystems)來提供PCR。反應(yīng)混合物(總體積50 μ I)組成為5 μ I含25mM MgCl2的IOx PCR緩沖液(“Fermentas”，Lithuania)、每種 dNTP200 μ M、每種所用的引物 25pmol 和 IU Taq 聚合酶(“Fermentas” , Lithuania)。向所述反應(yīng)混合物加入約5ng質(zhì)粒DNA作為PCR擴增用的模板DNA。溫度曲線設(shè)定如下:在95° C初始DNA變性5分鐘，其后是25個循環(huán)的95° C變性30秒、55° C退火30秒、72° C延伸40秒，和在72° C最終延伸5分鐘。然后將擴增的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化,使用“GenElute Spin Columns (GenElute自旋柱)”(Sigma, USA)提取,并用乙醇沉淀。
將獲得的DNA片段用于電穿孔和Red介導整合入大腸桿菌MG1655/pKD46的細菌染色體中。
將MG1655/pKD46細胞在含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的液體LB培養(yǎng)基中在30° C培養(yǎng)過夜，然后用含有氨芐青霉素(100μ g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)(使用阿拉伯糖來誘導含有Red系統(tǒng)的基因的質(zhì)粒)的SOB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l ；NaC10.5g/l ；胰蛋白胨20g/l ；KC12.5mM ；MgCl210mM)以1: 100稀釋，并且在30° C培養(yǎng)至細菌培養(yǎng)物的光密度達到0D_=0.4-0.7。將來自IOml該細菌培養(yǎng)物的經(jīng)培養(yǎng)細胞用冰冷的去離子水洗滌3次，其后在100 μ I水中懸浮。向該細胞懸液添加10 μ I溶解在去離子水中的DNA片段(IOOng)。用“Bio-Rad”電穿孔儀(USA) (N0.165-2098，2-89型)根據(jù)制造商的說明書進行電穿孔。將經(jīng)過電擊的細胞(shocked cell)添加至Iml SOC培養(yǎng)基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition(《分子克隆實驗手冊第二版》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)),在 37° C溫育 2 小時，然后涂布到含有25 μ g/ml氯霉素的L-瓊脂上。使用引物P3(SEQ ID NO:5)和P4(SEQ ID NO:6)通過PCR檢測生長了 24小時的菌落中取代天然tdh基因CmK標記的存在。為此，將新鮮分離的菌落懸浮在20 μ I水中，其后使用I μ I所得懸液進行PCR。溫度曲線設(shè)定如下:在95° C初始DNA變性5分鐘；其后是30個循環(huán)的95° C變性30秒、55° C退火30秒和72° C延伸40秒；以及在72° C最終延伸5分鐘。少數(shù)經(jīng)檢測的CmK菌落含有期望的1104bp DNA片段，其確認了取代tdh基因的1242bp片段的CmK標記DNA的存在。獲得的菌株之一通過在37° C培養(yǎng)消除了熱敏質(zhì)粒pKD46，并且將所得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 Δ tdh。
然后，將來自菌株VL614rhtA23 (Livshits VA.等，2003，Res.Microbiol.，154:123-135)的 rhtA23 突變引入獲得的菌株 MG1655 Λ tdh，產(chǎn)生菌株 MG1655Δ tdh, rhtAtrhtAZS是一種賦予對高濃度的蘇氨酸(>40mg/ml)和高絲氨酸(>5 mg/ml)的抗性的突變。為此用生長在供體菌株VL614rhtA23上的噬菌體Ρ1_感染菌株MG1655Atdh。在含有8mg/ml高絲氨酸和0.4%作為唯一碳源的葡萄糖的M9基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)導體。
實施例2.構(gòu)建大腸桿菌MG1655:: PL_tacadhE
通過用Puae啟動子替代菌株MG1655中adhE基因的天然啟動子區(qū)獲得了大腸桿菌 MG1655::PL_tacadh。
為了替代adhE基因的天然啟動子區(qū)， 通過Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97，6640-6645)描述的也稱為 “Red-介導的整合”和 / 或“Red-驅(qū)動的整合”的方法，將攜帶I/_ta。啟動子和由cat基因編碼的氯霉素抗性標記(CmK)的DNA片段整合到了大腸桿菌MG1655的染色體中來取代天然啟動子區(qū)。
使用大腸桿菌MG1655PL_taexylE (W02006/043730)的染色體DNA作為模板通過PCR獲得了含有IVta。啟動子和cat基因的片段。I/_ta。啟動子的核苷酸序列在序列表中提供(SEQID NO: 7) ο 使用引物 P5(SEQ ID NO: 8)和 P6 (SEQ ID NO: 9)用于 PCR 擴增。引物 P5 含有引入到該引物中的與位于adhE基因起始密碼子上游318bp的區(qū)域互補的40個核苷酸，用于進一步整合到細菌染色體中；引物P6含有與adhE基因的5’-序列相同的39個核苷酸。
使用“Gene Amp PCR System2700” 擴增設(shè)備(Applied Biosystems)來提供PCR。反應(yīng)混合物(總體積50 μ I)組成為5 μ I含15mM MgCl2的IOx PCR緩沖液(“Fermentas”，Lithuania)、每種 dNTP200 μ Μ、每種所用的引物 25pmol 和 IU Taq 聚合酶(“Fermentas”, Lithuania)。向所述反應(yīng)混合物加入約20ng大腸桿菌MG1655PL_tac;xylE基因組DNA作為PCR的模板。
溫度曲線如下:在95° C初始DNA變性5分鐘，其后是35個循環(huán)的95° C變性30秒、54° C退火30秒、72° C延伸1.5分鐘，和在72° C最終延伸5分鐘。然后將擴增的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化,使用“GenElute SpinCoIumns^ (Sigma, USA)提取,并用乙醇沉淀。將獲得的DNA片段用于電穿孔和Red介導的整合入大腸桿菌MG1655/pKD46的細菌染色體中。
將MG1655/pKD46細胞在含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的液體LB培養(yǎng)基中在30° C培養(yǎng)過夜，然后用含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)(使用阿拉伯糖來誘導編碼Red系統(tǒng)的基因的質(zhì)粒)的SOB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l ；NaC10.5g/l ；胰蛋白胨20g/l ；KC12.5mM ；MgCl210mM)以1:100稀釋，并且在30° C培養(yǎng)以達到細菌培養(yǎng)物的光密度OD6tltl=0.4-0.7。將來自IOml該細菌培養(yǎng)物的經(jīng)培養(yǎng)細胞用冰冷的去離子水洗滌3次，其后在100 μ I水中懸浮。向該細胞懸液添加10 μ I溶解在去離子水中的DNA片段(IOOng)。用“Bio-Rad”電穿孔儀(USA) (N0.165-2098,2-89型)根據(jù)制造商的說明書進行了電穿孔。
將經(jīng)過電擊的細胞添加至Iml SOC培養(yǎng)基(Sambrook等，“Molecular Cloning ALaboratory Manual, Second Edition”(《分子克隆實驗手冊第二版》)，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989))，在37° C溫育2小時，然后涂布到含有25 μ g/ml氯霉素的L-瓊月旨上。
將約100個所得克隆在含有2%乙醇作為唯一碳源的M9平板上進行選擇。選取了在36小時中在含有2%乙醇的M9平板上生長的一些克隆，并使用引物P7 (SEQ ID NO: 10)和P8(SEQ ID NO: 11)通過PCR檢測這些克隆中取代adhE基因天然啟動子區(qū)的CmK標記的存在。為此，將新鮮分離的菌落懸浮在20μ I水中，然后將1μ I所得懸液用于PCR。溫度曲線如下:在95° C初始DNA變性10分鐘；其后是30個循環(huán)的95° C變性30秒、54° C退火30秒和72° C延伸1.5分鐘；在72° C最終延伸I分鐘。少數(shù)經(jīng)檢測的CmK菌落含有期望的 1800bp DNA片段，這證實了取代adhE基因的520bp天然啟動子區(qū)的CmK標記DNA的存在。獲得的菌株之一通過在37° C的 培養(yǎng)消除了熱敏質(zhì)粒pKD46，并將所得的菌株命名為大腸桿菌MG1655::PL_taeadhE(參見圖1)。[0209]實施例3.構(gòu)建大腸桿菌 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE
通過將來自菌株MG1655::PL_taeadhE的P^ae啟動子轉(zhuǎn)導至菌株MG1655 Δ tdh, rhtA* 中獲得了大腸桿菌 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE0
用生長在供體菌株MG1655::PL_tacadhE上的噬菌體Plvi,感染菌株MG1655 Δ tdh, rhtA*,獲得了菌株 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE0 檢查這種菌株在含有 2%乙醇作為唯一碳源的M9平板上的生長。生長速率與菌株MG1655::PL_tacadhE的生長速率相同。
實施例4.增加adhE基因表達對L-蘇氨酸產(chǎn)生的影響
為了評估增強adhE基因的表達對L-蘇氨酸產(chǎn)生的影響,用質(zhì)粒pVIC40轉(zhuǎn)化了兩種大腸桿菌菌株 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE 和 MG1655 Δ tdh, rhtA*。
將菌株MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE (pVIC40)和親本菌株MG1655 Δ tdh, rhtA* (pVIC40)各自在營養(yǎng)培養(yǎng)液(nutrient broth)中在 37。C 培養(yǎng) 18 小時，將獲得的每種培養(yǎng)物的0.3ml接種到20x200mm試管中具有以下組成的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且用旋轉(zhuǎn)搖床在34° C培養(yǎng)48小時。表I和2顯示來自至少10次獨立實驗的數(shù)據(jù)。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/Ι):
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括: A)在含有乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有醇脫氫酶的腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細菌，和 B)從培養(yǎng)基中分離L-氨基酸， 其中編碼所述醇脫氫酶的基因在非天然啟動子的調(diào)控下表達，所述啟動子在有氧培養(yǎng)條件下有功能，并且 其中所述產(chǎn)生L-氨基酸的細菌是大腸桿菌或Pantoea ananatis。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述非天然啟動子選自下組:Pta。、Pla。、Ptrp>Ptrc>匕和PL。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其中所述醇脫氫酶對有氧失活有抗性。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3中任一項的方法，其中所述醇脫氫酶源于選自下組的細菌 大腸桿菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、Pantoeaananatis、植物乳桿菌和乳酸乳球菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-4中任一項的方法，其中所述醇脫氫酶包含SEQID N0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸殘基被替代為不是天冬氨酸殘基的另一種氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1-4中任一項的方法，其中所述醇脫氫酶包含SEQID N0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸殘基被替代為賴氨酸殘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5或6的方法，其中所述醇脫氫酶具有至少一個額外的突變，該突變能夠改進所述細菌在含有乙醇作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中的生長。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中所述額外的突變選自下組: A)用另一種氨基酸 殘基替代SEQID NO:2中位置560的谷氨酸殘基； B)用另一種氨基酸殘基替代SEQID NO:2中位置566的苯丙氨酸殘基； C)用其它氨基酸殘基替代SEQID NO: 2中分別在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和 D)以上各項的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中所述額外的突變選自下組: A)用賴氨酸殘基替代SEQID NO:2中位置560的谷氨酸殘基； B)用纈氨酸殘基替代SEQID NO:2中位置566的苯丙氨酸殘基； C)用甘氨酸殘基、纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基和纈氨酸殘基分別替代SEQID NO:2中分別在位置22、236、461、554和786的谷氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、酪氨酸殘基、異亮氨酸殘基和丙氨酸殘基；和 D)以上各項的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-9中任一項的方法,其中所述產(chǎn)生L-氨基酸的細菌屬于選自下組的屬:埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬和摩根氏菌屬。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項的方法，其中所述L-氨基酸選自下組:L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種使用腸桿菌科的細菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法，例如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸或L-谷氨酸，其中已經(jīng)對所述細菌進行了修飾以增強由adhE基因編碼的野生型醇脫氫酶或?qū)τ醒跏Щ钣锌剐缘耐蛔兇济摎涿傅幕钚浴?br>文檔編號C12P13/14GKCN103215319SQ201210557397
公開日2013年7月24日 申請日期2007年7月12日
發(fā)明者利奧尼德.R.普蒂特辛, 伊里納.B.奧爾特曼, 韋羅妮卡.A.科特利亞羅瓦, 奧爾佳.N.莫科瓦, 塔蒂亞納.A.亞姆波爾斯卡亞, 尤里.I.科茲洛夫, 寺下優(yōu), 臼田佳弘, 松井和彥 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan