專利名稱:大蒜病毒檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，專用于大蒜花葉病毒(GMV)、大蒜潛隱病毒(GCLV)的檢測。
二、技術(shù)背景大蒜(Alliμm sativum L.)是我國一種重要的出口蔬菜。但大蒜屬花粉敗育型植物，生產(chǎn)中主要靠鱗莖進(jìn)行無性繁殖。因此，病毒在大蒜營養(yǎng)器官中不斷積累增殖造成品種退化，使產(chǎn)量和質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響我國大蒜的生產(chǎn)和出口。大蒜病毒病屬于難治療病害，迄今還沒有一種有效的藥物。大蒜花葉病毒病是大蒜花葉病毒(GMV，Garlic mosaic virus)侵染大蒜植株引起的病害，其田間植株癥狀呈現(xiàn)出顯著黃色條紋花葉，葉片呈扭曲、折疊及萎縮狀態(tài)，病毒粒子體為700～800μm，以鱗莖、汁液、蚜蟲、薊馬及線蟲等傳毒。大蒜潛隱病毒病是大蒜潛隱病毒(GCLV，Garlic commonlatent virus)侵染大蒜植株引起的病害，其田間植株不表現(xiàn)出任何帶毒癥狀，即無癥帶毒，并不影響產(chǎn)量但在自然條件下，該病毒多數(shù)與大蒜花葉病毒混合侵染大蒜植株，被侵染的病株常常呈現(xiàn)出系統(tǒng)花葉癥狀。病毒粒子體為580～720μm，以鱗莖、汁液和蚜蟲等傳毒。目前，解決大蒜病毒主要是通過組織培養(yǎng)方法來生產(chǎn)脫毒大蒜，故建立靈敏、快速、簡便、商業(yè)化的檢測技術(shù)成為脫毒大蒜生產(chǎn)中應(yīng)迫切解決的問題。
自20世紀(jì)30代以來，大蒜病毒的檢測主要是依據(jù)植株本身的外觀癥狀和指示植物來進(jìn)行，這些方法需時較長，靈敏度較低，且受季節(jié)限制。20世紀(jì)70年代至80年代初期，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在大蒜病毒檢測上的應(yīng)用也越來越廣泛。免疫學(xué)方法檢測大蒜病毒的靈敏性大大提高，特異性也增強(qiáng)，檢測速度也有較大的提高，目前已成為最常用的大蒜病毒的檢測方法。
20世紀(jì)80年代中期以后，分子生物學(xué)的技術(shù)得到了快速的發(fā)展，為大蒜病毒的檢測提供了一種比上述幾種方法靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、速度更快的方法。
RT-PCR技術(shù)檢測病毒的基本原理是首先弄清待檢病毒RNA的全部或部分序列，并以此合成一對特異性引物(也可用隨機(jī)引物)；然后對病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增；對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，產(chǎn)生特異DNA譜帶，據(jù)此即可檢測病毒。RT-PCR技術(shù)作為一種國際通用的病毒檢測技術(shù)與其它檢測方法比較具有以下優(yōu)點(diǎn)①比ELISA更靈敏，特異性更好，結(jié)果更可靠；②與核酸分子雜交技術(shù)相比無放射性危險(xiǎn)；③與dsRNA電泳技術(shù)相比可檢測fg數(shù)量級的植物病毒及大規(guī)模樣品。因此該技術(shù)在大蒜病毒檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
國內(nèi)外特別是日本近年來已開始采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測大蒜病毒，效果良好，報(bào)道利用RT-PCR技術(shù)檢測的大蒜病毒有大蒜潛隱病毒(GCLV)等(ArchVirol.1998，1431093～1107)。但是，至今沒有大蒜RT-PCR病毒檢測試劑盒出現(xiàn)，市場上出售的一步RT-PCR試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)一步進(jìn)行，一旦某一環(huán)節(jié)出錯就必須從頭開始而造成的時間和藥品的浪費(fèi)，同時常用的RT-PCR反應(yīng)體系為100μl的大體系，造成大量藥品的浪費(fèi)，并且操作復(fù)雜容易造成污染，而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，建立大蒜GMV、GCLV病毒的RT-PCR檢測試劑盒和使用方法，為大蒜病毒檢疫和大蒜脫毒苗病毒檢測提供一種快速、準(zhǔn)確、操作方便、靈敏、特異性好的檢測方法。
技術(shù)方案1 一種大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒及陽性對照三部份1)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，含有PCR試劑管1和無RNA酶的水，其中PCR試劑管1內(nèi)含10×buffer，dNTP，MgCl2，RNA酶抑制因子，oligo-dT引物，反轉(zhuǎn)錄酶；每1支量7.5～15μl反轉(zhuǎn)錄試劑配制成分 試劑濃度 用量10×buffer 15mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/l 3～4μlRNA酶抑制因子 40U/μl 0.5～1μl
oligo-dT引物 0.1ug/μl 1～2μl反轉(zhuǎn)錄酶 200U/μl 1～2μl2)PCR試劑盒，含有PCR試劑管2、試劑A及試劑B，其中PCR試劑管2內(nèi)含l0×PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq酶，每1支量2.7～8.5μl PCR試劑配制成分 試劑濃度 用量10×PCR buffer 15mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 0.5～2μlTaq酶 5U/μl 0.2～0.5μl試劑A配制引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’和引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’用純水溶解到5～20pmol/μl；試劑B配制引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’和引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’用純水溶解到5～20pmol/μl；3)陽性對照，為從大蒜病葉中提取的，含有GMV、GCLV兩種病毒RNA的RNA。
2大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)向PCR試劑管1中加入0.1～1μg大蒜總RNA樣品和無RNA酶的水，使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，其條件為42℃、30分鐘，95℃、5分鐘，4℃、5分鐘；(2)PCR反應(yīng)取反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，加入PCR試劑管2中，再加入試劑A或試劑B，然后加入純水使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行32個循環(huán)；(3)電泳檢測在PCR反應(yīng)結(jié)束的PCR試劑管2中加入電泳上樣緩沖液，取反應(yīng)液在含瓊脂糖和溴化乙錠(EB)的凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察含有GMV病毒大蒜樣品的電泳檢測結(jié)果為擴(kuò)增出327bp的電泳條帶，含有GCLV病毒大蒜樣品的電泳檢測結(jié)果為擴(kuò)增出469bp的電泳條帶。
有益效果本發(fā)明所提供的大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1)本發(fā)明試劑盒經(jīng)特異性和靈敏度鑒定，證明特異性和靈敏度較高。
2)試劑被分裝在兩個PCR試劑管中，避免了操作過程中的污染，使用方便。
3)試劑盒反轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進(jìn)行，與市場上出售的一步RT-PCR試劑盒相比，避免了一旦由于一部分出錯就必須從頭開始而造成的時間和藥品的浪費(fèi)，并且反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)時可以設(shè)置重復(fù)，與一步RT-PCR試劑盒相比，增加了結(jié)果的可靠性。
4)試劑盒PCR部分采用20μl小反應(yīng)體系，與RT-PCR常用的100μl大反應(yīng)體系相比節(jié)約藥品，可降低成本。
本發(fā)明為大蒜病毒檢測提供了一種快速、準(zhǔn)確、操作方便、靈敏、特異性好的試劑盒，可以大大加速脫毒大蒜的推廣和應(yīng)用。
四、


圖1大蒜GMV病毒的RT-PCR擴(kuò)增條帶M為分子量marker，1、2、3、4為含有大蒜GMV病毒的大蒜樣品圖2大蒜GCLV病毒的RT-PCR擴(kuò)增條帶M為分子量marker，1、2、3、4為含有大蒜GCLV病毒的大蒜樣品圖3大蒜GMV病毒的RT-PCR靈敏性鑒定M為分子量marker，1、2、3、4、5分別為按1∶10∶20∶50∶100比例稀釋圖4大蒜GCLV病毒的RT-PCR靈敏性鑒定M為分子量marker，1、2、3、4、5分別為按1∶10∶20∶50∶100比例稀釋五具體實(shí)施方式
1、PCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GMV的外殼蛋白基因(Genbank數(shù)據(jù)庫編號AF500074)和GCLV的外殼蛋白基因(Genbank數(shù)據(jù)庫編號AF228416)設(shè)計(jì)引物，利用DNA合成儀合成2對引物GMVP1、GMVP2和GCLVP1、GCLVP2。合成的引物GMVP1、GMVP2擴(kuò)增位于GMV外殼蛋白基因的277bp～603bp之間的核苷酸序列，長度為327bp；合成的引物G-CLVP1、GCLVP2擴(kuò)增位于GCLV外殼蛋白基因的402bp～870bp之間的核苷酸序列，長度為469bp。
2、RT-PCR試劑盒的組裝
(1)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的組裝反轉(zhuǎn)錄試劑按表1配制，并分裝在PCR試劑管1(用DEPC處理并滅菌)中。
(2)PCR試劑盒的組裝①PCR試劑按表2配制，并分裝在PCR試劑管2中。
②試劑A配制，引物GMVP1(5’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’)和引物GMVP2(5’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’)用純水溶解到10pmol/μl。
③試劑B配制，引物GCLVP1(5’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’)和引物GCLVP2(5’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’)用純水溶解到10pmol/μl。
(3)陽性對照，從大蒜病葉中提取，含有GMV、GCLV兩種病毒RNA的RNA。
3、大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，向PCR試劑管1中加入0.1～1μg大蒜總RNA樣品和無RNA酶的水，使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其條件為42℃、30分鐘，95℃、5分鐘，4℃、5分鐘。
(2)PCR反應(yīng)，取1μl反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，加入PCR試劑管2中，再加入5μl試劑A或試劑B，然后加入純水使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行32個循環(huán)。
(3)電泳檢測，在PCR反應(yīng)結(jié)束的PCR試劑管B中加入3μl 6倍電泳上樣緩沖液0.25％(w/w)溴酚蘭溶液，取10μl在含2.0％(w/w)瓊脂糖和10μl/100ml溴化乙錠(EB)的膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察。
實(shí)施結(jié)果如下1特異性鑒定利用多種病毒(OYDV、GCLV、GMV、SLV)復(fù)合侵染的大蒜葉片檢測本試劑盒的特異性，結(jié)果表明，按照試劑盒的使用方法，GCLV和GMV都得到了清晰、準(zhǔn)確的擴(kuò)增條帶，利用Labwork4.0根據(jù)分子量marker測定的序列長度與預(yù)期設(shè)計(jì)長度327bp(圖1)和469bp(圖2)相吻合，證明該試劑盒有較高的特異性。
2靈敏度鑒定將含有GCLV、GMV病毒RNA的大蒜總RNA提取液按1∶10∶20∶50∶100比例稀釋，相當(dāng)于0.8μg，0.08μg，0.04μg，0.016μg，0.008μg，利用本試劑盒并按使用方法經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3、圖4所示，由圖3、圖4可知，除了稀釋100倍的RNA不能擴(kuò)增出條帶外，其它都可以擴(kuò)增出來，表明用RT-PCR檢測大蒜病毒有較高的靈敏度。
此外，本試劑盒反轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進(jìn)行，與市場上出售的一步RT-PCR試劑盒相比，避免了一旦由于一部分出錯就必須從頭開始而造成的時間和藥品的浪費(fèi)，并且反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)時可以設(shè)置重復(fù)，與一步RT-PCR試劑盒相比，增加了結(jié)果的可靠性。同時，本試劑盒PCR部分采用20μl小反應(yīng)體系，與RT-PCR常用的100μl大反應(yīng)體系相比節(jié)約藥品，可降低成本，本試劑盒所有試劑被分裝在兩個PCR試劑管中，與常用的RT-PCR相比避免了操作過程中的污染，使用方便。
表1反轉(zhuǎn)錄試劑


表2 PCR試劑


權(quán)利要求
1.一種大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒及陽性對照三部份1)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，含有PCR試劑管1和無RNA酶的水，其中PCR試劑管1內(nèi)含10×buffer，dNTP，MgCl2，RNA酶抑制因子，oligo-dT引物，反轉(zhuǎn)錄酶；2)PCR試劑盒，含有PCR試劑管2、試劑A及試劑B，其中PCR試劑管2內(nèi)含10×PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq酶，試劑A內(nèi)含引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’試劑B內(nèi)含引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’，引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’3)陽性對照，為從大蒜病葉中提取的，含有GMV、GCLV兩種病毒RNA的RNA。
2.權(quán)利要求
1所述大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括，(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)向PCR試劑管1中加入0.1～1μg大蒜總RNA樣品和無RNA酶的水，使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，其條件為42℃、30分鐘，95℃、5分鐘，4℃、5分鐘；(2)PCR反應(yīng)取反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，加入PCR試劑管2中，再加入試劑A或試劑B，然后加入純水使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行32個循環(huán)；(3)電泳檢測在PCR反應(yīng)結(jié)束的PCR試劑管2中加入電泳上樣緩沖液，取反應(yīng)液在含瓊脂糖和溴化乙錠的凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察含有GMV病毒大蒜樣品的電泳檢測結(jié)果為擴(kuò)增出327bp的電泳條帶，含有GCLV病毒大蒜樣品的電泳檢測結(jié)果為擴(kuò)增出469bp的電泳條帶。
專利摘要
本發(fā)明涉及大蒜病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，專用于大蒜花葉病毒(GMV)、大蒜潛隱病毒(GCLV)的檢測。試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒及陽性對照三部份。檢測方法，包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR反應(yīng)及電泳檢測，含有GMV病毒大蒜樣品的電泳檢測結(jié)果為擴(kuò)增出327bp的電泳條帶，含有GCLV病毒大蒜樣品的電泳檢測結(jié)果為擴(kuò)增出469bp的電泳條帶。本試劑盒PCR部分采用小反應(yīng)體系，節(jié)約藥品，降低成本，使用方便。通過特異性和靈敏度鑒定，證明本試劑盒特異性和靈敏度較高。
文檔編號C12Q1/68GKCN1233843SQ200410014721
公開日2005年12月28日 申請日期2004年4月22日
發(fā)明者侯喜林, 張昌偉, 史公軍, 王建軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan