專利名稱:一種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域：
，是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
二、技術(shù)背景
化學(xué)農(nóng)藥的使用大大地促進(jìn)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)挽回了大量因病蟲(chóng)害等原因造成的損失，并極大地提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動(dòng)效率和機(jī)械化程度，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)代化進(jìn)程中起了不可估量的作用。但同時(shí)農(nóng)藥都是一些有毒有害化學(xué)物質(zhì)，它們進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后，不僅殺死了對(duì)人類有害的生物，同時(shí)也對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的危害。農(nóng)藥的大量使用引起農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響了人民的身體健康及農(nóng)產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。隨著人們生活水平的提高和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，全社會(huì)對(duì)農(nóng)藥殘留帶來(lái)的直接危害和潛在影響亦愈來(lái)愈關(guān)注，人們迫切需要無(wú)農(nóng)藥殘留污染的清潔的綠色農(nóng)產(chǎn)品。但從目前我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形式和人口狀況來(lái)看，以停止農(nóng)藥使用降低農(nóng)業(yè)產(chǎn)量為代價(jià)的無(wú)公害生產(chǎn)模式是行不通的，農(nóng)藥作為控制病蟲(chóng)害的有效手段還將繼續(xù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮巨大的作用。如何能解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的這個(gè)兩難問(wèn)題就成為各個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室和實(shí)際應(yīng)用研究都表明利用微生物來(lái)降解消除土壤中的農(nóng)藥殘留“庫(kù)”容量，從而降低糧食、蔬菜、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留，提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值是可行的?，F(xiàn)有技術(shù)中本課題組已擁有降解菌的發(fā)明專利(ZL96106317.3，公開(kāi)號(hào)CN1145408A，
公開(kāi)日1997年3月19日)，該專利是一株芽胞桿菌J5，能有效地降解甲胺磷，但該菌株降解譜窄，僅能降解甲胺磷一種農(nóng)藥，從而使用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題和需求，開(kāi)發(fā)研制出一種新型的農(nóng)藥殘留降解菌劑，使用本菌劑可以使甲基對(duì)硫磷、辛硫磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留量降低90％以上，并對(duì)甲胺磷、甲基異柳磷也有一定的降解效果。具有較廣的降解譜，生產(chǎn)和使用成本較低。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過(guò)程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲(chóng)害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。
技術(shù)方案 下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容
本發(fā)明提供一種消除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌，其菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌DLL-1(2000年9月22日已寄存于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCC NO.0492)，經(jīng)鑒定屬惡臭假單胞菌屬(分類地位屬于Pseudomonas putida)。主要生物學(xué)特性為G-，菌體為短桿狀，末端橢圓，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，單端叢生鞭毛，兼性厭氣；過(guò)氧化氫酶、氧化酶和V.P.反應(yīng)為陽(yáng)性；能水解淀粉，不能還原硝酸鹽，能以甲基對(duì)硫磷為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物。該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為AF447394。利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-半乳糖、D-果糖，不利用甘露糖、乳糖、D-木糖及淀粉。最適生長(zhǎng)溫度30-35℃。該菌還能以氯苯、鄰苯二酚、苯甲酸、苯乙酸和辛硫磷為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)條件下甲基對(duì)硫磷的降解率達(dá)90％以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
使用上述有機(jī)磷農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種—搖瓶種—種子罐—生產(chǎn)罐—產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)。
本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施步驟為
1)將有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌DLL-1的試管種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。
3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同。
在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35℃，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液即為菌劑。
有益效果 使用該發(fā)明生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附近值具有重要的意義。降解菌DLL-1具有較廣的降解譜，能使甲基對(duì)硫磷、辛硫磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留量降低90％以上，并對(duì)甲胺磷、甲基異柳磷也有一定的降解效果。大大降低了生產(chǎn)和使用過(guò)程中的工作量，降低了生產(chǎn)和使用成本。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過(guò)程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲(chóng)害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。并且該菌為革蘭氏陰性菌，在田間的存活時(shí)間適當(dāng)不會(huì)影響以后農(nóng)藥使用的效果。
田間試驗(yàn)表明，用本發(fā)明生產(chǎn)的降解菌劑直接施用于農(nóng)作物可使作物中農(nóng)藥殘留量降低95％以上。本發(fā)明成功地解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn)題，既充分發(fā)揮了化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲(chóng)害防治中的高效快速的作用，又可以生產(chǎn)出無(wú)毒無(wú)公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
四具體實(shí)施方式
以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。
將本發(fā)明的微生物有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌DLL-1的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測(cè)定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml肉湯培養(yǎng)基1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完畢后121℃高壓濕熱滅菌，冷卻至33℃后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量為1∶0.8。將到達(dá)對(duì)數(shù)期的種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1kg/cm2的壓力下，121℃高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35℃以下，通無(wú)菌空氣保持無(wú)菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30-35℃，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1∶0.8-1.0，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。
發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
用上述方法所得的產(chǎn)品進(jìn)行田間農(nóng)藥殘留降解試驗(yàn)示范。在韭菜噴過(guò)有機(jī)磷類農(nóng)藥(甲基一六0五、辛硫磷、甲基異柳磷、甲胺磷、樂(lè)果等)后，將上述菌劑按使用方法要求施于菜地和茶園中，一定時(shí)間后，收獲韭菜和茶葉的葉片用氣相色譜和液相色譜法測(cè)定農(nóng)藥殘留的含量(由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)綠色食品測(cè)試中心和農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)總站測(cè)定)，從結(jié)果中看出經(jīng)降解菌處理后能大大降低植物中的殘留農(nóng)藥(表1、表2)。對(duì)于茶葉這樣相對(duì)較難處理的植物DLL-1也表現(xiàn)出較好的處理效果(表3)。
表1.DLL-1對(duì)甲胺磷、甲基一六0五和樂(lè)果的降解農(nóng)藥品種Pesticide 甲胺磷 甲基一六0五 樂(lè)果處理方式 CK DDL-1處 理 CK DDL-1處 理 CK DDL-1處理農(nóng)藥濃度(mg/L) 89 44 227 11 206.6 170降解率 (％) 51 95.2 17.7
表2 DLL-1對(duì)韭菜中甲基一六0五、辛硫磷及甲基異柳磷的降解.
(韭菜樣品分析報(bào)告)
送樣單位南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 樣品名韭菜
接受日期2000.10.18 檢測(cè)日期2000.10.19
檢測(cè)單位農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)總站
樣品分析報(bào)告
送樣單位南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 樣品名稱韭菜
接收日期2000.10.18 檢測(cè)日期2000.10.19樣品名稱 樣品號(hào) 編號(hào)檢測(cè)農(nóng)藥 檢測(cè)結(jié)果 (ppm) 韭菜甲基1605對(duì)照 (10.14) J-D-1甲基1605 4.3927 韭菜甲基1605對(duì)照 (10.16) J-D-2甲基1605 5.7959 韭菜甲基1605處理 (10.14) J-CH-1甲基1605 0.0956 韭菜甲基1605處理 (10.16) J-CH-2甲基1605 0.0267 韭菜辛硫磷對(duì)照 (10.14) X-D-1 辛硫磷 8.7441 韭菜辛硫磷對(duì)照 (10.16) X-D-2 辛硫磷 2.8287 韭菜辛硫磷處理 (10.14) X-CH-1 辛硫磷 0.4161 韭菜辛硫磷處理 (10.16) X-CH-2 辛硫磷 0.3376 韭菜甲基異柳磷對(duì)照(10.14) L-D-1甲基異柳磷 25.6417 韭菜甲基異柳磷對(duì)照(10.16) L-D-2甲基異柳磷 15.6816 韭菜甲基異柳磷處理(10.14) L-CH-1甲基異柳磷 15.8182 韭菜甲基異柳磷處理(10.16) L-CH-2甲基異柳磷 21.4240



表3.DLL-1對(duì)茶葉中一六0五的降解



權(quán)利要求
1.一種農(nóng)藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陰性的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的菌株DLL-1，2000年9月22日寄存于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.0492，主要生物學(xué)特性為G-，菌體為短桿狀，末端橢圓，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，單端叢生鞭毛，兼性厭氣；過(guò)氧化氫酶、氧化酶和V.P.反應(yīng)為陽(yáng)性；能水解淀粉，不能還原硝酸鹽，能以甲基對(duì)硫磷為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物，該菌株16SrDNA的Genbank登陸號(hào)為AF447394。
2.一種用權(quán)利要求
1所述的農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑，是通過(guò)以下方法生產(chǎn)而成
1)將試管種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為
葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5；
3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；
4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
專利摘要
本發(fā)明提供一種消除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌劑，所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌DLL－1，經(jīng)鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。主要生物學(xué)特性為G－，菌體為短桿狀，末端橢圓，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，單端叢生鞭毛，兼性厭氣；過(guò)氧化氫酶、氧化酶和V.P.反應(yīng)為陽(yáng)性；能水解淀粉，不能還原硝酸鹽，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為AF447394。降解菌產(chǎn)品直接施用可使作物中農(nóng)藥殘留量降低95％上，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn)題，可生產(chǎn)出無(wú)毒無(wú)公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N1/20GKCN1563356SQ200410014408
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月24日
發(fā)明者李順鵬, 劉智, 沈標(biāo), 洪青, 何健 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan