專利名稱：:從大麥產(chǎn)生乙醇和含有降低的β-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS的制作方法從大麥產(chǎn)生乙醇和含有降低的P-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS本發(fā)明要求在2007年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/918,163的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以其整體引入作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及淀粉水解過程的方法，其用于在低于淀粉膠化溫度的溫度下，從碾碎的植物材料中獲得適合于動(dòng)物祠料的含降低水平的p-葡聚糖和肌醇六磷酸DDGS。發(fā)明背景來自可再生原料的乙醇具有作為化石燃料持久替代品滿足當(dāng)今社會(huì)最大挑戰(zhàn)之一的可能性，尤其是在運(yùn)輸部門，可以減少溫室氣體排放。在2005年，在美國(guó)生產(chǎn)了151億升(40億加侖)的燃料乙醇。目前有109種投產(chǎn)的植物具有198億升(52億加侖)的容量，53種尚未投產(chǎn)植物的容量將增加至357億升(94億加侖)(2006年12月數(shù)據(jù))。在美國(guó)，玉米是乙醇生產(chǎn)的主要原料，例如，在2006年，約20。/。的美國(guó)玉米供應(yīng)用于生產(chǎn)燃料乙醇，以取代僅3-4%的汽油供應(yīng)。為了避免"燃料對(duì)食物，，問題，需要玉米原料的替代品。其中，大麥具有成為乙醇生產(chǎn)備選原料的巨大可能性，尤其在中部大西洋州和其它州，在那里大麥?zhǔn)嵌巨r(nóng)作物，允許與大豆復(fù)種。估計(jì)在北美洲，大麥每年可提供至少十億加侖的乙醇，其為2006年美國(guó)總乙醇產(chǎn)量的約20%。然而，在美國(guó)沒有工廠使用大麥作為原料，因?yàn)槠匠５娜ご篼溡蛞韵略蛟诓唤?jīng)修改的常規(guī)玉米到遺傳工廠中不能被處理l)去殼大麥的磨蝕性質(zhì)將損壞谷粒處理和研磨設(shè)備，因而提高資本成本，2)大麥的低淀粉含量(50-55%)與玉米相比將導(dǎo)致更低的乙醇產(chǎn)量，對(duì)于相同的容量，需要將大麥工廠建造的比玉米工廠更大，3)因P-葡聚糖造成的大麥醪液的高粘度，和4)產(chǎn)生具有高水平(5-葡聚糖的干酒糟與可溶物(DDGS)副產(chǎn)品，其不能用于家禽、豬和水產(chǎn)業(yè)飼料，這限制了該副產(chǎn)品在家禽和豬生產(chǎn)領(lǐng)域中的價(jià)值。為了大麥到燃料乙醇方法在經(jīng)濟(jì)上成功，必須克服上述技術(shù)障礙。該文章的目的是開發(fā)用于乙醇生產(chǎn)的基于大麥的STARGENtm方法。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及從碾碎的植物材料水解淀粉的方法，其包括在低于碾碎的植物材料中顆粒淀粉的初始膠化溫度的溫度下將碾碎的植物材料與內(nèi)源植物肌醇六磷酸酶、葡糖淀粉酶和微生物a-淀粉酶的酶組合接觸，以得到可發(fā)酵的糖。本發(fā)明還涉及在發(fā)酵微生物的存在下使可發(fā)酵糖發(fā)酵成終產(chǎn)物。在另一實(shí)施方案中，所述方法使用酶組合中的p-葡聚糖酶。在實(shí)施方案中提供了包含來自酵母發(fā)酵的DDGS的動(dòng)物飼料，所述DDGS基本上不含肌醇六磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案，低于起始膠化溫度的溫度為約25°C到約77°C,或約50。C到約80。C。一方面，終產(chǎn)物是DDGS并且所述DDGS基本上沒有肌醇六磷酸。另一方面，終產(chǎn)物是DDGS并且所述DDGS基本上沒有卩-葡聚糖。在任一情況下，DDGS均可用于動(dòng)物飼料。一方面，碾碎的植物材料是大麥、小麥或黑麥。酶組合物還可包括次要酶，如第二種葡糖淀粉酶、第二種a淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、P-葡聚糖酶、環(huán)糊精反式轉(zhuǎn)糖基酶(transglycosyltransferase)、p-淀粉酶及其組合。一方面，漿液的pH處于約pH3到約pH7之間。漿液可與酶組合物保持接觸約2小時(shí)至約240小時(shí)。酶組合可作為混合物或單獨(dú)加入漿液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，碾碎的植物材料包括大麥、高粱、玉米或其組合物，并在約3.5至約5.5的pH5范圍內(nèi)，在約30-約45°C的溫度范圍和約48小時(shí)至約90小時(shí)的時(shí)間內(nèi)同時(shí)進(jìn)行接觸和發(fā)酵步驟，并且至少約50%的淀粉被溶解。在其它實(shí)施方案中，終產(chǎn)物是乙醇并且產(chǎn)量高于約8%。其它實(shí)施方案是從碾碎的植物材料發(fā)酵乙醇的方法，包括通過將碾碎的植物材料的漿液與葡聚糖淀粉酶及微生物a-淀粉酶的酶組合在低于碾碎植物材料中顆粒淀粉的初始膠化溫度的溫度下接觸，以獲得可發(fā)酵糖(其中所述碾碎植物材料包含內(nèi)源肌醇六磷酸酶)；并且在發(fā)酵微生物的存在下使可發(fā)酵糖發(fā)酵成乙醇。酶的組合可作為混合物加入或單獨(dú)加入，并且酶的所述組合還可包括p-葡聚糖酶。發(fā)酵也可導(dǎo)致產(chǎn)生具有降低的肌醇六磷酸和p-葡聚糖減少的DDGS,其可用于動(dòng)物飼料。本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)將在以下詳細(xì)描述中變得顯而易見。然而，應(yīng)理解詳細(xì)說明和特定實(shí)施例在說明本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的同時(shí)，僅作為說明給出，因?yàn)閺脑撛敿?xì)說明，本發(fā)明范圍和精神內(nèi)的多種改變和修改將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖l是說明大麥漿液粘度譜的圖。圖2說明了常規(guī)的大麥到乙醇的生產(chǎn)方法。圖3概述了發(fā)酵過程中的乙醇生產(chǎn)。圖4概述了30。/oDS去殼大麥發(fā)酵結(jié)果。圖5是說明在30%DS去殼大麥中OPTIMASHtmBG對(duì)乙醇產(chǎn)量影響的圖。圖6概述了低能量乙醇生產(chǎn)方法。發(fā)明詳述現(xiàn)在僅通過使用以下定義和實(shí)例的參考詳細(xì)描述本發(fā)明。此處涉及的所有專利和出版物，包括該專利和出版物中公開的所有序列明確地引入本文作為參考。6除非此處另有說明，此處所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義。Singleton,等，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，第二版，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所用許多術(shù)語(yǔ)的常用字典。盡管類似于或等同于此處所述的任何方法和材料均可用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中，^f旦描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字。除非另有指出，核酸以5'到3'的方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左到右書寫。尤其指導(dǎo)從業(yè)者從Sambrook等，1989，和AusubelFM等，1993中獲得本領(lǐng)域的定義和術(shù)語(yǔ)。應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法學(xué)、方案和試劑，因?yàn)檫@些都會(huì)變化。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字。除非另有指出，核酸以5，到3'的方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左到右書寫。此處提供的949)和Aspergillusshiro眼mi(參閱Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499畫505;Chen等(1995)Prot.Eng.8:575-582;和Chen等，(1994)BiochemJ.302:275-281)。也可以從踝節(jié)菌屬(Talaromyces)菌林，如來源于T.emersonii、T.iileycetta扁、T.duponti和T，thermophilus(WO99/28488;USPNo.RE:32,153;USPNo.4,587,215);木霉屬菌林，如里氏木霉(T.reesei)的葡糖淀粉酶，尤其是與美國(guó)專利公開號(hào)2006-0094080中公開的SEQIDNO:4具有至少80%、85%、90%和95%序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉屬菌林，^口雪白才艮霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae);毛霉屬菌林和腐質(zhì)霉屬(H腿icola)菌林，如灰腐質(zhì)霉(H.grisea)(參閱，Boel等，(1984)EMBOJ.3:1097畫1102;WO92簡(jiǎn)81;WO00/04136;Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499-505;Taylor等，(1978)CarbohydrateRes.61:301-308;USP.4,514,496;USP4，092，434;USP4,618,579;Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34:218—223和WO2005/052148的SEQIDNO:3)的葡糖淀粉酶。在一些實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶將與WO05/052148的SEQIDNO:3的氨基餅列有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。用于本發(fā)明的其它葡糖淀粉酶包括從羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)及其變種(WO04/111218)獲得的那些。具有葡糖淀粉酶活性的商用的酶可通過，例如，黑曲霉(參見例如商品名DISTILLASE,OPTIDEXL-400和GZYMEG9卯4X，產(chǎn)自GenencorInternationalInc.)或根霉屬物種(參見例如商品名CU.CONC，產(chǎn)自ShinNihonChemicals,日本)產(chǎn)生。也包括商購(gòu)的消化酶，商品名GLUCZYME，產(chǎn)自AmanoPharmaceuticals,曰本(參見例如Takahashietal"(1985)J.Biochem.98:663-671)。其它酶包括來自一種根霉屬的三種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3),命名為"Glucl"(MW74,000)，"Gluc2"(MW58，600)和"Gluc3"(MW61,400)。也發(fā)現(xiàn)酶制劑GC480(GenencorInternationalInc.)可用于本發(fā)明。微生物來源的a-淀粉酶在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，方法包括使碾碎的植物材料與外源植物a-淀粉酶、葡糖淀粉酶及微生物來源的a-淀粉酶的組合接觸。任何合適的a-淀粉酶均可用作本發(fā)明的微生物a-淀粉酶。在一些實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶來源于細(xì)菌菌林，而在其它實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶來源于真菌菌林。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選的a-淀粉酶是細(xì)菌a-淀粉酶。在其它實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶是酸穩(wěn)定的a-淀粉酶。合適的a-淀粉酶可以是天然發(fā)生的以及重組的(雜合和變體)和突變a-淀粉酶(WO99/19467和WO97/41213)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶來源于芽孢桿菌種。優(yōu)選的芽孢桿菌種包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、凝固芽孢桿菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)(USP5,093,257;USP5,763,385;USP5,824,532;USP5,958,739;USP6,008,026、USP6,361，809;USP6,867,031;WO96/23874;WO96/39528和WO05/001064)。特別優(yōu)選的a-淀粉酶來源于芽孢桿菌菌林嗜熱脂肪芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌((USP6,187,576;USP6，093，562;USP5,958,739;US2006/0014265和WO99/19467)。這種a-淀粉酶包括野生型、雜合的及變異的a-淀粉酶。參閱Suzuki等，(1989)J.Biol.Chem.264:18933-18938和US2006/0014265,尤其是SEQIDNO:3、4和16。也參考具有美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)號(hào)-ATCC39709;ATCC11945;ATCC6598;ATCC6634;ATCC8480;ATCC9945A和NCIB8059的菌林。除細(xì)菌a-淀粉酶外，也考慮真菌a-淀粉酶用于本發(fā)明的方法。合適的真菌a-淀粉酶來自絲狀真菌菌林，如曲霉，如米曲霉和黑曲霉(例如FUNGAMYL和CLARASEL)和木霉屬、根霉屬、毛霉屬和青霉屬。考慮用于本發(fā)明方法的市售a-淀粉酶包括SPEZYMEAA;SPEZYMEFRED;SPEZYMEETHYL;GZYMEG997;CLARASEL(GenencorInternationalInc.);TERMAMYL120-L,LC，SC和SUPRA(NovozymesBiotech);LIQUOZYMEX和SANSUPER(NovozymesA/S)和ULTRATHIN(A/alleyResearch)。13在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，方法包括使植物材料與外源植物a-淀粉酶、葡糖淀粉酶和p-葡聚糖酶的組合接觸。P-葡聚糖酶的類型并不是至關(guān)重要的，但優(yōu)選地，所述P-葡聚糖酶能夠水解P-葡聚糖。因此，具有該性質(zhì)的已知的或開發(fā)的任何p-葡聚糖酶可用于本發(fā)明的方法。也稱作內(nèi)切葡聚糖酶I、II和III的P-葡聚糖酶(內(nèi)切纖維素酶-酶分類法EC3.2.1.4)是攻擊纖維素纖維以釋放更小纖維素片段的酶，所述纖維素片段被外切纖維素酶進(jìn)一步攻擊釋放葡萄糖。P葡聚糖酶也可用于本發(fā)明的方法。用于本發(fā)明方法中的商品化p-葡聚糖酶包括OPTIMASHBG和OPTMASHTBG(Danisco，US,Inc.GenencorDivision)。發(fā)酵生物發(fā)酵生物的實(shí)例是產(chǎn)乙醇微生物和產(chǎn)生乙醇的微生物，如表達(dá)乙醇脫氫酶和丙酮酸脫氬酶并可從Zymomonasmoblis獲得的產(chǎn)乙醇細(xì)菌(參閱例如USP5，000，000;USP5,028,539，USP5，424，202;USP5,514,583和USP5，554，520)。在額外的實(shí)施方案中，產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，其為轉(zhuǎn)化木糖成木酮糖的酶。在其它實(shí)施方案中，木糖異構(gòu)酶用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用能夠?qū)⑽焯呛图禾前l(fā)酵成乙醇的微生物。例如，在一些實(shí)施方案中，所述微生物可以是天然的或非遺傳改造的微生物，或在其它實(shí)施方案中，所述微生物可以是重組微生物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的發(fā)酵微生物包括來自芽孢桿菌、乳桿菌(Lactobacillus)、大腸桿菌(E.coli)、歐文氏菌(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)(例如，檸檬泛菌(P.citrea))、假單胞菌(Pseudomonas)和克雷伯氏菌(Klebsiella)(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的細(xì)菌菌林。(參閱例如USP5,028,539、USP5，424，202和WO95/13362)。用于發(fā)酵步驟的發(fā)酵微生物將取決于待生產(chǎn)的終產(chǎn)物。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生乙醇的微生物是真菌微生物，如酵母，并尤其是酵母屬,i口酉良酒酵母(S.cerevisiae)菌林(USP4,316,956)。釀酒酵母的變種可通過商業(yè)途徑獲得，并且這些包括但不限于FALI(Fleischmann'sYeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSMSpecialties"REDSTAR(Lesaffre)和Angel乙醇酵母(AngelYeastCompany,China)。次要酶盡管本發(fā)明的實(shí)施方案包括內(nèi)源植物肌醇六磷酸酶、微生物來源的葡糖淀粉酶和微生物來源的a-淀粉酶，但是接觸步驟和/或發(fā)酵步驟還包括其它酶與發(fā)酵微生物和其它組分。額外的酶包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、P-葡聚糖酶、環(huán)糊精反式轉(zhuǎn)糖基酶、p-淀粉酶及其組合。p-葡聚糖酶的使用可幫助降低醪液粘度。方法步驟在一些實(shí)施方案中，包含顆粒淀粉的碾碎植物材料與水溶液混和，以獲得漿液。漿液可以具有約5-約60%;10接觸步驟的pH范圍在約pH3.0到約pH7.0之間；也在約pH3.5到約6.5之間；也在約pH4.0到約6.0之間并且進(jìn)一步在約pH4.0到約5.5之間。漿液在低于碾碎植物材料中顆粒淀粉的淀粉膠化溫度的溫度下與酶保持接觸。在一些實(shí)施方案中，溫度保持在約25。C到約75。C之間；在其它實(shí)施方案中，溫度保持在約30。C到約70°C之間；約30。C到約65。C之間；約40。C到約65°C之間；約55°C到約70。C之間、約60°C到約65°C之間；約55°C到約65°C之間、約55°C到約78°C之間，和在約55°C到約68。C之間。在其它實(shí)施方案中，溫度為至少約25°C、30°C、35°C、40。C、45。C、48。C、50oC、53。C、55。C、58。C、60oC、63。C、65。C和680C。在其它實(shí)施方案中，溫度不高于約65。C、68。C、70。C、73。C、750C和80。C。根據(jù)本文方法^f吏用的許多顆粒淀粉的初始淀粉膠化溫度范圍包括大麥(52。C到59。C)、小麥(58。C到64。C)、黑麥(57。C到70。C)、玉米(62。C到72。C)、高直鏈淀粉玉米(67。C到80。C)、稻(68。C到77。C)、高粱(68。C到77。C)、馬鈴薯(58。C到68。C)、木薯淀粉(59。C到69。C)和甘薯(58。C到72。C)。(JJ.M.Swinkels第32—38頁(yè)，StarchConversionTechnology,編輯VanBeynum等，(1985)MarcelDekkerInc.NewYork和TheAlcoholTextbook第三版AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries,編輯Jacques等，(1999)NottinghamUniversityPress,UK)。在接觸步驟中，漿液與酶保持接觸約2小時(shí)到約240小時(shí)；還保持約2小時(shí)到約120小時(shí)；還保持約5小時(shí)到約卯小時(shí)；約5小時(shí)到約72小時(shí)；和約5小時(shí)到約48小時(shí)。用于接觸步驟中的a-淀粉酶的有效濃度將根據(jù)所用的特定方法條件和顆粒淀粉而變化。然而，通常所用的a-淀粉酶的量將在約0.001到約50AAU/gDS、約0.01到約30AAU/gDS、約0.01到約10AAU/gDS和約0.05到約5.0AAU/gDS的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，接觸步驟和/或發(fā)酵步驟中a-淀粉酶的有效劑量是約0.01到約25SSU/gDS;也是約0.01到約15SSU/gDS;也是約0.05到約10SSU/gDS;也是約0.1到約10SSU/gDS;也是約0.1到約10SSU/gDS和約0.5到約5SSU/gDS。在一些實(shí)施方案中，接觸步驟和/或發(fā)酵步驟中葡糖淀粉酶的有效劑量在約0.01到約20GAU/gDS;還在約0.01到約15GAU/gDS;還在約0.05到約10GAU/gDS;還在約0.1到約10GAU/gDS并甚至在約0.5到約5GAU/gDS的范圍內(nèi)。在接觸步驟中，溶解約20-約95%的顆粒淀粉以產(chǎn)生可發(fā)酵糖，如寡糖。在一些實(shí)施方案中，溶解高于約40%、高于約50%、高于約60%、高于約70%、高于約80%和高于約90%的淀粉。在一些實(shí)施方案中，溶解的淀粉包含高于約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%和80%的葡萄糖。在一些實(shí)施方案中，包含可發(fā)酵糖的醪液可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物，如高果糖。在其它實(shí)施方案中，可發(fā)酵糖與發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵。接觸步驟和發(fā)酵步驟可在同一反應(yīng)容器中同時(shí)或順序進(jìn)行。通常，在TheAlcoholTextbook第三版，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries,編輯Jacques等，(1999)NottinghamUniversityPress,UK中描述了發(fā)酵方法。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，醪液與酵母在約15到約40。C、約20到約38°C，還在約25到約35°C的溫度下；在約pH3.0到約6.5;還在約pH3.0到約6.0;約pH3.0到約5.5、約pH3.5到約5.0，并且還在約pH3.5到約4.5的pH范圍中發(fā)酵約5小時(shí)到約120小時(shí)，優(yōu)選約12到約120并更優(yōu)選約24到約90小時(shí)，產(chǎn)生醇產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇。通常以每ml發(fā)酵液104到1012，優(yōu)選107到10"個(gè)活酵母菌數(shù)的量供應(yīng)酵母細(xì)胞。發(fā)酵除了發(fā)酵微生物(例如酵母)營(yíng)養(yǎng)物外，還將包括任選的酸和額外的酶。在一些實(shí)施方案中，除了上述原料，發(fā)酵培養(yǎng)基將含有補(bǔ)充物，包括但不限于維生素(例如維生素H、葉酸、煙酸、核黃素)、輔因子和大量和微量營(yíng)養(yǎng)素及鹽(例如(NH4)2S04;K2HP04;NaCl;MgS04;H3B03;ZnCl2;和CaCl2)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，碾碎的植物材料包括大麥、高粱、玉米及其組合，并且接觸和發(fā)酵步驟在3.5到5.5的pH范圍、30圍內(nèi)同時(shí)進(jìn)行48到90小時(shí)，其中至少50%的淀粉凈皮溶解?；厥沾己推渌K產(chǎn)物本發(fā)酵方法的優(yōu)選終產(chǎn)物是醇產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇?？蓮陌l(fā)酵培養(yǎng)基中分離和/或純化根據(jù)本方法產(chǎn)生的終產(chǎn)物。分離和純化方法是已知的，例如通過使培養(yǎng)基進(jìn)行提取、蒸餾和柱層析。在一些實(shí)施方案中，通過使培養(yǎng)基經(jīng)過高壓液相層析(HPLC)分析直接鑒定終產(chǎn)物。在其它實(shí)施方案中，例如通過離心將醪液分離成液相和固相，并回收終產(chǎn)物如醇和固體。通過例如蒸餾和分子篩脫水或超濾回收醇。在一些實(shí)施方案中，乙醇的產(chǎn)量以體積計(jì)將高于約8%、10%、12%、14%、16%和18%。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的乙醇可用作燃料乙醇、飲料乙醇或工業(yè)乙醇。17酒糟加可溶物(DDGS)，其可用作動(dòng)物飼料。在其它實(shí)施方案中，通過使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)發(fā)酵微生物，發(fā)酵終產(chǎn)物可包括但不限于甘油、1，3-丙二醇、葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更尤其是當(dāng)乳酸是想要的終產(chǎn)物時(shí)，可使用乳桿菌(干酪乳桿菌(L.casei));當(dāng)甘油或1，3-丙二醇是想要的終產(chǎn)物時(shí)，可使用大腸桿菌；當(dāng)2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸和2-酮基-L-古洛糖酸是想要的終產(chǎn)物時(shí)，可使用檸檬泛菌作為發(fā)酵微生物。以上列表僅是實(shí)例，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可適用于獲得想要的終產(chǎn)物的許多發(fā)酵微生物。在以下實(shí)驗(yàn)7>開內(nèi)容中，應(yīng)用以下縮寫eq(當(dāng)量)；M(摩爾的)；jiM(微摩爾的)；N(正常)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；nmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克);mg(毫克)；kg(千克)；網(wǎng)(微克)；L(升);ml(毫升)；jil(微升);cm(厘米)；mm(毫米)；,(微米)；nm(納米)；°C(攝氏度)；h(小時(shí))；min(分);sec(秒);msec(毫秒)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；nCi(微居里);TLC(薄層層析)；Ts(曱苯磺?；?；Bn(節(jié)基)；Ph(苯基)；Ms(曱磺?；?；Et(乙基)、Me(曱基)。實(shí)施例在以下實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明，所述實(shí)施例旨在不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。認(rèn)為附圖是說明書的整體部分和本發(fā)明的描述。供以下實(shí)施例以闡明，但不限制本發(fā)明。在以下實(shí)施例中，所用的材料是去殼大麥(ThoroughbredLot1504-1，于2005年生長(zhǎng))獲得于VirginiaFoundationSeedCenterFarmatMt.Holly,Virginia。通過USDAEasternRegionalResearchCenter(ERRC)進(jìn)行去殼大麥的表征并總結(jié)于下表中(在干重基礎(chǔ)上)。表l去殼大麥的化學(xué)及物理表征水分％(碾磨的米粒)7.85灰分％2.32油％1.92淀粉％59.89蛋白質(zhì)％7.60《饗3.90酸性去污劑纖維(。/。ADF)5.47中性去污劑纖維(。/。NDF)17.22泮JL纖維(Y。CF)4.66Ibs/bu52.94商品化里氏木霉(Trichodermareesd)OPTIMASHTMBG(卩-葡聚糖酶)、酸穩(wěn)定的a-淀粉酶、STARGENtm001(顆粒淀粉水解酶)、FERMGENtm(蛋白酶)來自GenencorDivision,ADaniscoCompany。實(shí)施例1該實(shí)施例說明了p-葡聚糖酶對(duì)粘度降低的影響使用大麥用于乙醇生產(chǎn)的具體問題是大麥醪液的粘度因P-葡聚糖含量成為了較高固體水平下的關(guān)鍵問題。大麥醪液的高粘度使得攪拌、液化、糖化和發(fā)酵在技術(shù)上變得困難并大大增加了操作成本。因此，對(duì)于大麥的干研磨發(fā)酵處理，需要非淀粉水解酶，如纖維素酶和p-葡聚糖酶用于降低粘度至可接受水平。檢測(cè)的p-葡聚糖酶是OPTIMASIFMBG，其含有有效修飾并消化非淀粉碳水化合物——植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)的酶組合。在30%DS制備大麥醪液并調(diào)整至pH3.6。在混和并調(diào)整pH后，將漿液轉(zhuǎn)移到HaakeViscotesterVT550的測(cè)定管中。粘度計(jì)預(yù)熱至57°C。在粘度測(cè)定開始時(shí)直接加入OPTIMASHtmBG。在57。C的溫度下開始啟動(dòng)粘度計(jì)并允許運(yùn)行90分鐘。90分鐘后，溫度降至32°C(發(fā)酵溫度)，粘度計(jì)保持運(yùn)行額外30分鐘。圖1顯示了漿液的粘度譜。結(jié)果表明OPTIMASHtmBG幫助降低了大麥醪液的粘度。此外，對(duì)照在沒有OPTIMASIFMBG的情況下運(yùn)行。粘度計(jì)不能達(dá)到57。C測(cè)試溫度，因?yàn)檗D(zhuǎn)子在54。C停止，表明對(duì)照醪液對(duì)于測(cè)定而言過于粘稠。用OPTIMASHTMBG處理大麥漿液可以有效減少與含有高水平卩-葡聚糖的漿液相關(guān)的粘度問題。粘度的降低可以解決泵送并處理醪液的問題。實(shí)施例2以下實(shí)施例詳細(xì)描述了顆粒淀粉水解酶(GSHE)用于大麥發(fā)酵的用途。在典型的干研磨谷粒乙醇生產(chǎn)中，首先碾碎整個(gè)谷粒，然后進(jìn)行處理而不將谷粒的多種成分分離出去。碾碎的谷粒與水和成漿液。加入a淀粉酶和P葡聚糖酶后，在58-60。C蒸煮漿液以降低大麥醪液的粘度。然后在高溫(85-88°C)蒸煮所述漿液以在稱作液化的過程中使淀粉膠化并液化。高溫也降低了所得醪液中的微生物污染物水平。液化后，冷卻醪液并加入第二種酶(葡糖淀粉酶)以在稱作糖化的過程中將液化的淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(葡萄糖，也稱為右旋糖)。向醪液中加入酵母，以將糖發(fā)酵成乙醇和二氧化碳。該過程稱作發(fā)酵。圖2說明了常規(guī)大麥到乙醇的生產(chǎn)過程。通常，這是能量密集過程，其需要向淀粉顆粒漿液中加入熱能直至超過淀粉的膠化溫度。在Genencor，我們已經(jīng)開發(fā)了酶產(chǎn)品的STARGENtm系，其為用于有效水解顆粒(未蒸煮的)狀態(tài)中淀粉的低能過程中的顆粒淀粉水解酶。該新技術(shù)具有消除需要淀粉高能處理并提供成本更有效的葡萄糖生產(chǎn)用于轉(zhuǎn)化成乙醇和其它生物產(chǎn)品及生物材料的可能性。因?yàn)槟茉谕蝗萜髦型瑫r(shí)進(jìn)行多個(gè)谷粒處理步驟(液化、糖化和發(fā)酵)，該方法也具有在乙醇設(shè)施中降低設(shè)備和投資成本的能力。產(chǎn)品的STARGENtm系包括酶的混合物，其對(duì)顆粒淀粉具有協(xié)同活性?；旌衔锇╝淀粉酶和葡糖淀粉酶，其可根據(jù)底物在淀粉顆粒中"鉆"孔或"剝落"淀粉顆粒。在該文中，我們對(duì)大麥發(fā)酵應(yīng)用該新的酶才支術(shù)。20制備27-30%DS碾磨的去殼大麥并使用硫酸調(diào)整pH至3.6。以等同于每p屯谷粒(kg/噸)0.2kg的劑量向漿液加入OPTIMASHTMBG，并以0.13kg/噸加入酸穩(wěn)定的a淀粉酶(t-57。C，pH=3.6)(見表2-粘度降低情況)。然后將漿液置于57。C水浴中1.5小時(shí)。在溫育過程中，用高架混合機(jī)輕輕攪拌漿液。大麥淀粉在57。C不被膠化，所述溫度低于大麥的膠化溫度。在該步驟中沒有觀察到粘度問題。表3顯示了去殼大麥HPLC譜、上清液Brix和％溶解的結(jié)果。HPLC組成顯示19.78%葡萄糖、20.90%DP2、8.80。/oDP3和50.53。/o更高級(jí)的糖。28.4%的大麥淀粉#皮溶解。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>加入400ppm尿素的情況下，同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵(SSF)。在每一劑量下，以一式三份進(jìn)行發(fā)酵。以1.56kg/噸STARGENtm001和0.1kg/噸FERMGENTM加入酶。在多個(gè)時(shí)間間隔，取出啤酒樣品用于HPLC分析。圖3概述了發(fā)酵過程中的乙醇生產(chǎn)。結(jié)果顯示發(fā)酵在45-50小時(shí)內(nèi)結(jié)束，產(chǎn)生11.80%v/v乙醇。在另一實(shí)驗(yàn)中，使用30。/oDS去殼大麥。同樣，沒有粘度問題。圖4概述了30。/。DS去殼大麥發(fā)酵的結(jié)果。尤其是，在發(fā)酵過程中葡萄糖濃度保持非常低(0.048-0.067%)的事實(shí)(見表4中用STARGENtm001進(jìn)行發(fā)酵期間的HPLC結(jié)果)將導(dǎo)致增加活性酵母群并限制不想要的污染孩t生物的生長(zhǎng)。使用STARGENTM酶對(duì)顆粒淀粉的直接轉(zhuǎn)化允許非常低的可溶性固體的極高比重發(fā)酵。這顯著降低了酵母的滲透應(yīng)力并可導(dǎo)致更高濃度的乙醇和最終蒸餾步驟中更高的吞吐量。所施加的更低的滲透應(yīng)力也導(dǎo)致酵母產(chǎn)生更低水平的廢物，像甘油，并且降低的甘油生產(chǎn)使得更多的葡萄糖被轉(zhuǎn)化成乙醇。表4用STARGENtm001發(fā)酵期間的HPLC結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>除了以上劑量的STARGENtm和FERMGENtm，在發(fā)酵過程中以0.1kg/噸加入OPTIMASHTMBG對(duì)乙醇產(chǎn)量沒有影響，如圖5中所示。然而，在SSF步驟中加入OPTIMASHtmBG具有進(jìn)一步降低醪液粘度的益處，因此改善下游處理。通常，STARGENTM酶技術(shù)(圖6)為乙醇生產(chǎn)提供了多種潛在的益處，所述技術(shù)能夠通過SSF過程中淀粉解聚成葡萄糖將不可溶顆粒(未蒸煮的)淀粉水解成可發(fā)酵糖。上述結(jié)果清楚地證明了利用STARGENTM酶消除了噴射蒸煮(jetcooking),其可導(dǎo)致明顯的能量節(jié)省。此外，STARGENtm方法比表5中所見的常規(guī)方法產(chǎn)生更高的乙醇產(chǎn)量(14.87%相比于14.60%)(ComparisonofHulledBarleyFermentation)。對(duì)于STARGENtm方法，可獲得0.538kg乙醇/kg淀粉，對(duì)應(yīng)于95.8%的發(fā)酵效率。表5去殼大麥發(fā)酵的比較乙醇。/oV/V標(biāo)準(zhǔn)差％常規(guī)方法14.600.08STARGENtm方法14.870.06實(shí)施例3該實(shí)施例描述了DDGS在殘留淀粉、P-葡聚糖和肌醇六磷酸方面的表征。發(fā)酵后，在強(qiáng)制空氣烘箱中將啤酒干燥以獲得DDGS。然后測(cè)定殘留的淀粉含量、P-葡聚糖和肌醇六磷酸。DDGS中的殘留淀粉和P-葡聚糖總結(jié)于表6中(DDGS中的殘留淀粉和P-葡聚糖含量)。可以看出，常規(guī)方法產(chǎn)生低于1%的殘留淀粉，而STARGENTM方法產(chǎn)生2.5%的殘留淀粉，表明在SSF過程中淀粉的極好轉(zhuǎn)化。去殼大麥中的p-葡聚糖含量是3.90y。并且SSF后的殘留p-葡聚糖水平在0.3-0.4%之間。換言之，高于95%的P-葡聚糖被水解，導(dǎo)致具有極低水平p-葡聚糖的DDGS。表6DDGS中的殘留淀粉和P-葡聚糖殘留淀粉％p-葡聚糖。/。STARGENtm方法2.510.37常規(guī)方法0.960.39玉米的干研磨發(fā)酵通常產(chǎn)生含有高水平肌醇六磷酸的DDGS，因?yàn)榧〈剂姿嶂写嬖诘牧姿猁}因單胃動(dòng)物有限的消化能力而不能得到利用，所以從動(dòng)物飼料制劑觀點(diǎn)看，高水平的肌醇六磷酸是不想要的。因而，來自糞肥中攜帶的未使用肌醇六磷酸的進(jìn)入土壤中的顯著量的磷因來自動(dòng)物糞便，尤其是來自豬和家禽的糞便對(duì)環(huán)境的污染已經(jīng)成為一些國(guó)家關(guān)注的問題。有趣的是，在大麥STARGENtm方法中，由于推測(cè)在57°C下1.5小時(shí)的粘度降低步驟過程中內(nèi)源大麥肌醇六磷酸酶對(duì)肌醇六磷酸的水解，從酵母發(fā)酵中所得的DDGS基本上沒有肌醇六磷酸(去殼大麥樣品中的肌醇六磷酸是0.36。/。)。因而，大麥STARGENTM方法能夠產(chǎn)生含有減少的j3-葡聚糖且沒有肌醇六磷酸的DDGS。清楚地證明了使用非淀粉水解酶和STARGENTM酶技術(shù)用于大麥發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)更高的乙醇產(chǎn)量、含有減少的P-葡聚糖并且不含有肌醇六磷酸的DDGS、用更少的步驟消除了噴射蒸煮、更少的資產(chǎn)裝備和更少的能量。同時(shí)，發(fā)酵罐中低濃度的可發(fā)酵糖導(dǎo)致增加活性酵母群，和SSF的低pH，限制了不想要的污染微生物的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明STARGENtm醉與非淀粉粘度降低酶的使用允許乙醇生產(chǎn)者更多工具，其將幫助在增加總的工廠產(chǎn)量和吞吐量的同時(shí)處理谷粒漿液成為乙醇。應(yīng)理解此處所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為說明性目的，并且多種修改或改變將被暗示給本領(lǐng)域技術(shù)人員，并且包括在該申請(qǐng)的精神和范圍和所述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。此處引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)為了所有目的特此引入作為參考。權(quán)利要求1.水解來自碾碎的植物材料的淀粉的方法，其包括將碾碎植物材料的漿液與葡糖淀粉酶和微生物α-淀粉酶的酶組合在低于該碾碎植物材料中顆粒淀粉的初始膠化溫度的溫度下接觸，以獲得可發(fā)酵糖，其中所述碾碎的植物材料包含內(nèi)源肌醇六磷酸酶。2.權(quán)利要求1的方法，其還包括在發(fā)酵微生物的存在下將所述可發(fā)酵糖發(fā)酵成終產(chǎn)物。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述酶組合還包括p-葡聚糖酶。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述低于初始膠化溫度的溫度為約250C到約77°C。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述低于初始膠化溫度的溫度為約50。C到約80。C。6.權(quán)利要求2的方法，其中所述終產(chǎn)物是DDGS并且所述DDGS基本上沒有肌醇六磷酸。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述終產(chǎn)物是DDGS并且所述DDGS基本上沒有p-葡聚糖。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述DDGS用作動(dòng)物伺料。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述DDGS用作動(dòng)物飼料。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述碾碎的植物材料是大麥、小麥或黑麥。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶組合物還包含至少一種次要酶，其選自第二種葡糖淀粉酶、第二種a淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、p-葡聚糖酶、環(huán)糊精反式轉(zhuǎn)糖基酶、P-淀粉酶及其組合。12.權(quán)利要求l的方法，其中所述漿液的pH為約pH3到約pH7。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述漿液與酶組合物保持接觸約2小時(shí)到約240小時(shí)。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述酶組合是混合物。15.權(quán)利要求l的方法，其中所述酶組合不是混合物。16.權(quán)利要求2的方法，其中所述碾碎的植物材料包括大麥、高粱、玉米或其組合，并且所述接觸步驟和發(fā)酵步驟在約3.5到約5.5的pH范圍內(nèi)，約30到約45。C的溫度范圍內(nèi)同時(shí)進(jìn)行約48到約卯小時(shí)，其中至少約50%的淀粉纟皮溶解。17.權(quán)利要求2的方法，其中所述終產(chǎn)物是乙醇并且所述產(chǎn)量高于約8%。18.從碾碎的植物材料發(fā)酵乙醇的方法，其包括將碾碎的植物材料的漿液與葡糖淀粉酶和微生物a-淀粉酶的酶組合在低于該碾碎的植物材料中顆粒淀粉的初始膠化溫度的溫度下接觸，以獲得可發(fā)酵糖，其中所述碾碎的植物材料包含內(nèi)源肌醇六磷酸酶；和在發(fā)酵微生物存在下將可發(fā)酵糖發(fā)酵成乙醇。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述酶組合還包括p-葡聚糖酶。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述發(fā)酵還導(dǎo)致產(chǎn)生具有減少的肌醇六磷酸和p-葡聚糖的DDGS。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述DDGS用于動(dòng)物飼料。專利摘要本文描述的是制備含有降低水平的β-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS的方法，所述DDGS適合用于動(dòng)物飼料。文檔編號(hào)C12P19/20GKCN101680005SQ200880007886公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年3月12日發(fā)明者G·科普涅茨尼-揚(yáng)達(dá),J·K·舍蒂,P·特尼塞恩,勉李申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan