本發(fā)明涉及多肽和免疫學，具體涉及嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原表位肽、應用及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（eosinophil?cationic?protein，ecp）是一種由嗜酸性粒細胞（eos）釋放的堿性蛋白，也稱為核糖核酸酶3（rnase?3），由rnase?3基因編碼，是rnase?a?蛋白超家族的成員。ecp是活化eos釋放的強堿性蛋白中的重要組分，可以直接殺傷病原體，參與調(diào)節(jié)免疫，促進炎癥反應和免疫細胞的聚集。同時它又是eos活化的重要標志，反映了eos的活化程度。在與嗜酸性粒細胞活化相關(guān)的臨床疾病中，如過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎或關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病的患者ecp水平會升高。ecp含量還與哮喘的嚴重程度有關(guān)。在哮喘發(fā)作期，ecp含量較高，當炎癥程度減輕達緩解期時ecp含量降低。因此，ecp含量的升高可以提示氣道炎癥等相關(guān)疾病的發(fā)生，反映臨床病情的嚴重程度，可用于過敏性哮喘、鼻炎、特應性皮炎等疾病的輔助診斷。

2、臨床和研究中檢測ecp的理想方法為免疫檢測，通常需要基于ecp抗體進行抗原抗體反應，因此需要有特異性的ecp抗原及抗體。

3、ecp與rnase?a?蛋白超家族的其他成員序列相似性較高。特別是嗜酸性粒細胞源性神經(jīng)毒素（edn/rnase?2）,是嗜酸性粒細胞釋放的另一種蛋白質(zhì)，ecp與edn的氨基酸序列相似度達71.64%。并且ecp有三種天然糖基化形式?(分子量分別為18、20和22?kda)，因此常規(guī)方法制備的抗體很容易與ecp的類似物產(chǎn)生免疫交叉反應，或不能識別所有糖基化、非糖基化的ecp類型，導致檢測方法特異性不足。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是常規(guī)方法制備的抗體很容易與ecp的類似物產(chǎn)生免疫交叉反應，或不能識別所有糖基化、非糖基化的ecp類型，導致檢測方法特異性不足，目的在于提供一種嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原表位肽、應用及試劑盒，解決了檢測方法特異性不足的問題。

2、本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原表位肽，嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原表位肽為seq?id?no.1和seq?id?no.2氨基酸序列所示的多肽的組合。

4、抗原表位肽①是ecp蛋白n端第16至25位的一段，含10個氨基酸的肽段，加賴氨酸（k）、絲氨酸（s）兩個氨基酸組成，氨基酸序列為seq?id?no.1；抗原表位肽②是ecp蛋白n端第112至123位的一段，含12個氨基酸的肽段，加k、s兩個氨基酸組成，氨基酸序列為seq?idno.2。賴氨酸側(cè)鏈較長且有伯胺，便于后續(xù)步驟的偶聯(lián)；絲氨酸含有一個極性的羥基（oh），親水且提供構(gòu)象靈活性，使得表位肽更容易形成抗原結(jié)合位點。上述抗原表位肽通過生物信息學方法分析和實驗確認，具有良好的抗原性，與ecp同源蛋白—rnase?a?蛋白超家族成員的對應局部肽段結(jié)構(gòu)差異較大，且不包含ecp的天然糖基化位點。

5、①seq?id?no.1：ksislnpprcti

6、②seq?id?no.2：ksdnrdprdspryp

7、第二方面，本發(fā)明提供一種嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原，包含上述的嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原表位肽。

8、作為一種可能的設(shè)計，上述嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原的制備方法，包括：

9、使用雙功能交聯(lián)劑將嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原表位肽與載體蛋白偶聯(lián)，得到嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗原；

10、所述雙功能交聯(lián)劑包括磺基琥珀酰亞胺?4-(n-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽（nhs-酯-馬來酰亞胺），所述載體蛋白包括人血清白蛋白（hsa）、鑰孔血藍蛋白?(klh)、牛血清白蛋白(bsa)、或雞卵清白蛋白（ova卵清蛋白）。

11、優(yōu)選的，上述載體蛋白為鑰孔血藍蛋白。

12、第三方面，本發(fā)明提供一種嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗體，所述嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗體是上述抗原制備而成的單克隆抗體或多克隆抗體。

13、第四方面，?本發(fā)明提供上述嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗體在制備嗜酸性粒細胞陽離子蛋白定量檢測試劑盒中的應用。

14、第五方面，本發(fā)明提供一種定量檢測嗜酸性粒細胞陽離子蛋白的試劑盒，包括上述的嗜酸性粒細胞陽離子蛋白抗體。

15、上述試劑盒可用方法學包括磁微粒管式化學發(fā)光法、膠乳凝集法和流式熒光發(fā)光法等。

16、化學發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式。該技術(shù)的原理是利用化學反應釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物等），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而進行分析。化學發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。磁微粒管式發(fā)光采用粒徑極小的納米磁微粒作為固相載體，擁有更快的反應速度和靈敏度，遠遠強于酶標板或纖維素膜的結(jié)合能力，使得固相能裝載更多的包被物。超順磁性磁微粒，在磁場作用下能快速聚合和分離，洗滌更徹底和快速。相比較下，板式發(fā)光固相載體多為酶標板，固/液相反應接觸面積小，反應不徹底，測量結(jié)果變異較大，靈敏度也較低，所以在目前對定量檢測要求越來越高的情況下，其使用逐漸受到限制。

17、膠乳增強免疫比濁法是利用抗原抗體在緩沖中快速形成網(wǎng)狀的抗原-抗體分子復合物，使反應液出現(xiàn)濁度，透光率下降。在一定的比例范圍內(nèi)，反應液的濁度和抗原抗體的量呈線性相關(guān)關(guān)系。其基于抗原抗體特異性反應以及膠乳增強放大的原理，具有靈敏度高，特異性好，抗干擾能力強等優(yōu)點。小尺寸的膠乳顆粒的具有較大的表面積，能增加抗體的結(jié)合效率，加快反應速度；均相反應的條件，易于實現(xiàn)自動化檢測，檢測具有較高的準確度和一致性。

18、流式熒光發(fā)光法，又稱?懸浮陣列、?液相芯片等，是一種多指標聯(lián)合診斷技術(shù)。該技術(shù)以熒光編碼微球為核心，結(jié)合流式原理、?激光分析和高速數(shù)字信號處理等多種技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)多指標并行分析。其工作原理是將熒光標記后的單細胞（或顆粒）懸液進入吸樣管，隨鞘液進入流動室。在檢測區(qū)，液流、激光和探測器互相垂直并聚焦于一點，實現(xiàn)流體動力聚焦。熒光標記的細胞或顆粒在激光激發(fā)下發(fā)出散射光和熒光的發(fā)射波，這些信號被檢測器獲取并經(jīng)處理后輸入計算機，由軟件進行分析處理。流式熒光發(fā)光法具有高通量、高靈敏度、并行檢測等特點。該技術(shù)最多可一管同時準確定量檢測多種不同的生物分子，大大提高了檢測效率。

19、以上三種方法學還能實現(xiàn)高程度的自動化，是實現(xiàn)定量檢測分析要求的重復性、線性、準確度等指標效果較好的方法。相比較下，免疫層析（膠體金、熒光層析）、板式發(fā)光或酶聯(lián)免疫法（elisa）等方法學存在自動化程度不高、反應非均相等缺點，導致重復性不佳、準確度差等問題，不滿足本發(fā)明檢測定量分析的要求。

20、作為一種可能的設(shè)計，上述包括磁微?；瘜W發(fā)光法反應體系，所述磁微?；瘜W發(fā)光法反應體系包括緩沖液、單克隆抗體和校準品，所述單克隆抗體為上述單克隆抗體。

21、作為一種可能的設(shè)計，上述包括膠乳凝集反應體系，所述膠乳凝集反應體系包括r1試劑和r2試劑，所述r1試劑包括緩沖液、表面活性劑和防腐劑，所述r2試劑包括嗜酸性粒細胞陽離子蛋白乳膠顆粒、抑菌劑和表面活性劑。

22、作為一種可能的設(shè)計，上述嗜酸性粒細胞陽離子蛋白乳膠顆粒通過如下方法制備：

23、將兩種不同粒徑的羥基微球混合后加入緩沖液，反應活化，得到微球混合液；

24、將微球混合液與雙交聯(lián)劑反應后，清洗離心后，超聲，得到重懸浮微球液；

25、將上述多克隆抗體用緩沖液稀釋后，與重懸浮微球液混合，孵育，清洗離心后，超聲，得到嗜酸性粒細胞陽離子蛋白乳膠顆粒。

26、不同粒徑微球可與不同濃度范圍的目標分析物產(chǎn)生最佳的免疫反應，小粒徑微球與低濃度分析物，大粒徑微球與高濃度分析物的結(jié)合效果更佳。兩種粒徑的微球聯(lián)用可擴展方法的線性范圍，提高靈敏度。

27、優(yōu)選的，上述羥基微球為jsr?life?sciences生產(chǎn)的。

28、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

29、本發(fā)明提供了一種ecp抗原表位肽，基于該表位肽制備的抗體具有高特異性、強結(jié)合力，不會與edn或rnase?a超家族的其他蛋白發(fā)生交叉反應，并且可以檢測糖基化和非糖基化的ecp。包含這兩種抗體的試劑盒，用于ecp的定量檢測，具有較好的臨床應用價值。