本發(fā)明涉及生物，具體地，涉及一種限制性內切酶pvui的生產方法。

背景技術：

1、細菌體內存在“限制-修飾”系統(tǒng)，即自身的dna被甲基轉移酶修飾，從而避免所產生的限制性內切酶對自身dna片段的切割，達到抵御外來噬菌體侵染的目的。因此在原核表達體系中單一的重組表達限制性內切酶，會使宿主因基因組dna被切割而死亡。而甲基轉移酶在識別序列上的特異性修飾可防止限制性內切酶的切割。限制-修飾基因常緊密連鎖，細菌通過調控兩者的表達，胞內相關的甲基轉移酶對與其配對限制性內切酶識別的相同特定序列進行甲基化修飾，并使修飾的dna具有抵抗其限制性內切酶切割的特性，保護宿主dna，降解未被甲基化的外源dna。

2、pvui是一種ii型限制性內切酶，來源于普通變形桿菌（proteus?vulgaris），其識別序列為5'-cgatcg-3'，廣泛應用于基因工程研究。傳統(tǒng)的制備方法是從細菌中直接分離純化pvui限制性內切酶，制備周期長、產量低，而且提取出的pvui限制性內切酶的活性和穩(wěn)定性不高。

3、在ep0374771a1中僅構建了pvui限制性內切酶基因重組表達質粒去做表達，沒有構建甲基化保護酶質粒，然，單獨表達的pvui會使宿主因基因組dna被切割而死亡，故而，表達菌株不能大規(guī)模復制。因此，尋找合適的pvui甲基化修飾酶對pvui識別的dna序列進行甲基化保護在pvui限制性內切酶表達中尤為關鍵。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供了一種能夠用于限制性內切酶pvui表達時對其識別序列進行甲基化保護的甲基轉移酶m.xorii，m.xorii識別并甲基化pvui的識別序列5'-cgatcg-3'，因此能夠對限制性內切酶pvui的識別序列進行甲基化修飾，從而避免表達的限制性內切酶pvui切割宿主dna導致宿主不能正常生長。

2、本發(fā)明提供了一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：包含采用甲基轉移酶m.xorii對pvui識別序列進行甲基化保護的步驟。

3、關于甲基化保護的方案可選自：m.xorii甲基轉移酶對pvui識別序列進行甲基化保護，或者選用其他甲基轉移酶如m.afa22mi等均可實現(xiàn)上述目的。

4、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于：采用含有限制性內切酶目的基因的表達質粒，與含有甲基化轉移基因的甲基化保護質粒共同轉化的方法進行。

5、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于，具體的生產方法如下所示：

6、s1.構建pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒；

7、s2.構建pbad-pvui表達質粒；

8、s3.將構建成功的pbad-pvui表達質粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒共同轉化感受態(tài)細胞后，篩選出的陽性克隆即為pvui表達菌株；

9、s4.誘導表達限制性內切酶pvui；

10、s5.純化限制性內切酶pvui。

11、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于：上述構建pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒的具體方法為將m.xorii進行dna序列大腸桿菌密碼子優(yōu)化,合成引物擴增pcr產物無縫克隆到用xbai/kpni酶切好的pacyc184載體上，轉化感受態(tài)細胞，構建pacyc184-m.xorii甲基化保護質粒。

12、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于：上述構建pbad-pvui表達質粒的具體方法為在pvui氨基酸序列c端添加標簽，進行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，合成引物擴增pcr產物無縫克隆到用bamhi/bsai酶切好的pbad載體上，轉化感受態(tài)細胞，構建pbad-pvui表達質粒。

13、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于：上述將構建成功的pbad-pvui表達質粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒共同轉化感受態(tài)細胞后，篩選出的陽性克隆即為pvui表達菌株的具體方法為將構建成功的pbad-pvui表達質粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒共同轉化感受態(tài)細胞，涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗lb平板上篩選陽性克隆，陽性克隆含有pbad-pvui和pacyc184-m.xorii兩種質粒，經(jīng)測序驗證，這兩種質粒均測序正確，測序正確的陽性克隆即為pvui的表達菌株。

14、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于：上述誘導表達限制性內切酶pvui的具體方法為將構建好的pvui表達菌株用無菌的lb液體培養(yǎng)基稀釋后，取稀釋后的菌液涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗lb平板，37℃過夜培養(yǎng)；在平板上挑取單克隆接種于含卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)至菌液濃度od600不小于0.8；將擴大培養(yǎng)的菌液轉接到含卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床，培養(yǎng)至菌液濃度od600?不小于?1.2；加入誘導劑，于37℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)。

15、進一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征還在于：上述純化限制性內切酶pvui的具體方法為將pvui表達菌株誘導培養(yǎng)后的菌體經(jīng)高壓裂解、離心、柱層析處理后得到純化的蛋白。

16、本發(fā)明的作用和效果：

17、本發(fā)明提供的一種全新的用于限制性內切酶pvui表達的甲基化保護方法，采用甲基轉移酶m.xorii對pvui識別序列進行甲基化保護，成功構建了pvui識別序列甲基化保護陽性菌株，避免了表達的限制性內切酶pvui切割宿主dna，該甲基化保護陽性菌株能夠成功應用于限制性內切酶pvui的生產。利用“限制-修飾”系統(tǒng)可大規(guī)模制備pvui限制性內切酶。

18、正常限制性內切酶的表達，需要同時構建一種含有限制性內切酶目的基因的表達質粒，一種含有甲基化轉移基因的甲基化保護質粒，分別構建成功后，先將含有甲基化轉移基因的甲基化保護質粒轉化er2566感受態(tài)細胞，再制備成含有甲基化轉移基因的甲基化保護質粒的er2566感受態(tài)細胞，最后將含有限制性內切酶目的基因的表達質粒轉入含有甲基化轉移基因的甲基化保護質粒的er2566感受態(tài)細胞中誘導表達限制性內切酶。

19、但是，在本發(fā)明的研究中發(fā)現(xiàn)，共同轉化方法同樣適用于本發(fā)明的生產工藝，在本發(fā)明的工藝中，先分別構建成功pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒和pbad-pvui表達質粒，再將pbad-pvui表達質粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒共同轉化er2566感受態(tài)細胞，無需先單獨用pacyc184-m.xorii甲基化保護酶質粒轉化er2566后再制備er2566+pacyc184-m.xorii感受態(tài)細胞的繁瑣步驟，簡化了共同轉化的流程。

技術特征：

1.一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：包含采用甲基轉移酶m.xorii對pvui識別序列進行甲基化保護的步驟。

2.如權利要求1所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：

3.如權利要求1所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于，具體的生產方法如下所示：

4.如權利要求3所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：

5.如權利要求3所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：

6.如權利要求3所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：

7.如權利要求3所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：

8.如權利要求3所述的一種限制性內切酶pvui的生產方法，其特征在于：

技術總結
本發(fā)明提供了一種限制性內切酶PvuI的生產方法，其特征在于：包含采用甲基轉移酶M.XorII對PvuI識別序列進行甲基化保護的步驟。該方法采用甲基轉移酶M.XorII對PvuI識別序列進行甲基化保護，成功構建了PvuI識別序列甲基化保護陽性菌株，避免了表達的限制性內切酶PvuI切割宿主DNA，該甲基化保護陽性菌株能夠成功應用于限制性內切酶PvuI的生產。利用“限制?修飾”系統(tǒng)可大規(guī)模制備PvuI限制性內切酶。

技術研發(fā)人員：寧光武,王繼宏,程若東,王剛
受保護的技術使用者：愷佧生物科技（上海）有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19