本發(fā)明涉及一種水凝膠基載體，特別涉及一種水凝膠基的活性微生物載體及制備方法和應(yīng)用，屬于水凝膠及微生物檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、霉菌和酵母菌是發(fā)酵工業(yè)中重要的微生物，也是食品工業(yè)中常見的腐敗菌。在一定條件下，被侵染的食品品質(zhì)、色澤、風(fēng)味等發(fā)生劣變，喪失食用價(jià)值。受污染的食品可引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙、系統(tǒng)性霉菌病，霉菌過敏癥，哮喘，鼻炎，肺炎，缺血性腦卒中等，存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此加強(qiáng)食品中霉菌和酵母菌的檢測是保障食品安全，維護(hù)消費(fèi)者健康的重要手段。

2、天然水凝膠是一類具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，其良好生物相容性能夠保障其作為載體在受到生理環(huán)境、生物標(biāo)志物和生物顆粒等因素刺激時其結(jié)構(gòu)和形貌發(fā)生改變從而展示出高選擇性和高靈敏性的理想生物響應(yīng)行為。其中，具有生物活性指示作用的生物酶，作為生物響應(yīng)材料的靶向目標(biāo)，為水凝膠基載體的生物響應(yīng)材料拓寬了研究領(lǐng)域和應(yīng)用范圍。盡管如此，天然水凝膠作為載體基質(zhì)仍存在潛在實(shí)際應(yīng)用缺陷，如機(jī)械性能弱，容易在流體狀態(tài)時迅速斷裂，導(dǎo)致對物理、化學(xué)和生物化學(xué)信號表達(dá)的控制有限等。介于水凝膠在溶膠-凝膠過程中水溶液中凝膠聚合物鏈間相互作用，形成具有親水性三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時會形成瞬態(tài)結(jié)點(diǎn)，并基于聚合物鏈自身攜帶的親水基團(tuán)如-oh、-cooh和-nh2從而產(chǎn)生具有良好的粘附力和生物相容性的凝膠體系。因此，通過凝膠組件和交聯(lián)調(diào)節(jié)水凝膠動態(tài)誘導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)載體策略提高水凝膠對霉菌和酵母菌的適配性，強(qiáng)化動態(tài)凝膠網(wǎng)絡(luò)對目標(biāo)微生物生化效應(yīng)的響應(yīng)性，對于進(jìn)一步優(yōu)化霉菌和酵母菌的檢測效率具有際應(yīng)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水凝膠基的活性微生物載體，由天然瓜爾膠、魔芋膠和2-氧代丙酸鈉鹽協(xié)同作用構(gòu)建基于物理交聯(lián)的三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)gg@2-oas@kgm，制備方法如下：

2、(1)將天然瓜爾膠(gg)和魔芋膠(kgm)在恒溫條件下烘干至恒重過篩，按一定比例稱取過篩后的瓜爾膠和魔芋膠漩渦振蕩均勻；

3、作為優(yōu)選，瓜爾膠和魔芋膠的烘干恒定溫度為30℃，過篩的目數(shù)為140目；瓜爾膠和魔芋膠質(zhì)量比為3:1。

4、(2)將2-氧代丙酸鈉鹽(2-oas)在恒溫條件下烘干至恒重，充分研磨過篩后，置于去離子水中配置成2-oas溶液；

5、作為優(yōu)選，2-氧代丙酸鈉鹽的烘干恒定溫度為30℃，過篩的目數(shù)為140目；2-oas溶液中2-氧代丙酸鈉鹽的質(zhì)量濃度為2％。

6、(3)按一定比例將瓜爾膠和魔芋膠混合物置于2-oas溶液中勻速攪拌20min，置于28℃恒溫條件下充分溶脹平衡，凍干獲得水凝膠基的活性微生物載體gg@2-oas@kgm；制得的水凝膠基載體gg@2-oas@kgm中，2-氧代丙酸鈉鹽(2-oas)占gg、kgm和2-oas總質(zhì)量的比為10～90％。

7、作為優(yōu)選，瓜爾膠(gg)、魔芋膠(kgm)和2-氧代丙酸鈉鹽(2-oas)的質(zhì)量比為3:1:1。

8、本發(fā)明提供的一種水凝膠基的活性微生物載體，可用于霉菌和/或酵母菌的生長載體。

9、本發(fā)明提供的一種水凝膠基的活性微生物載體，還可用于霉菌和/或酵母菌的快速檢測。

10、進(jìn)一步的，本發(fā)明提出一種水凝膠基載體gg@2-oas@kgm作為活性微生物載體用于霉菌和酵母菌的快速檢測方法，其中g(shù)g、2-oas和kgm在水凝膠體系中的比例為3:1:1(w/w/w)，在該比例條件下，協(xié)同胞外酶顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽鈉鹽和十六碳酸4-硝基苯酯對霉菌和酵母菌的檢出時間為36～42h，顯著縮短平板計(jì)數(shù)法檢測時間(3～5d)。

11、進(jìn)一步的，本發(fā)明提出一種霉菌和酵母菌的快速檢測方法，步驟包括：將終濃度為2.0mg/ml的顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽鈉鹽和十六碳酸4-硝基苯酯與無菌營養(yǎng)基質(zhì)溶于去離子水中凍干，獲取含有顯色底物的無菌營養(yǎng)基質(zhì)凍干粉，無菌營養(yǎng)基質(zhì)凍干粉與本發(fā)明提供的一種水凝膠基的活性微生物載體按9:1的比例漩渦混勻后均勻涂附于透明聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚氯乙烯夾板中制成霉菌和酵母菌檢測卡片，將制備好的霉菌和酵母菌檢測卡片滅菌；取1ml待測樣品懸液均勻接種于檢測卡片中，于28℃恒溫培養(yǎng)36h后，觀察霉菌和酵母菌熒光和可見光的可視化菌落特性。

12、作為可選的，本發(fā)明提出2-氧代丙酸鈉鹽(2-oas)的一種新應(yīng)用，包括：

13、在水凝膠基載體gg@2-oas@kgm中，2-oas協(xié)同kgm為天然gg提供新的交聯(lián)位點(diǎn)，可作為gg立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)劑；提高天然水凝膠gg和kgm的機(jī)械性能和凝膠穩(wěn)定性。

14、進(jìn)一步的，kgm與2-oas在水凝膠基載體gg@2-oas@kgm中占gg、kgm和2-oas總質(zhì)量的比均為1:5(w/w)時，對于降低gg基體三維網(wǎng)絡(luò)孔壁厚度增加，孔壁間距增大，表面孔隙均勻性增強(qiáng)，表面積增加具有顯著的調(diào)節(jié)作用。

15、作為可選的，本發(fā)明還提出2-氧代丙酸鈉鹽(2-oas)的另一種新應(yīng)用，包括：

16、2-oas可作為霉菌和酵母菌在水凝膠基載體gg@2-oas@kgm立體微環(huán)境中的生長助劑。外源性2-oas抗自由基的特性能夠改善菌體的氧化還原作用，維持霉菌和酵母菌在水凝膠立體網(wǎng)絡(luò)微空間中的生物活性。

17、進(jìn)一步的，在水凝膠基載體gg@2-oas@kgm中，以國標(biāo)gb4789.15-2016中描述的瓊脂平板計(jì)數(shù)法為參照，在不干擾菌落計(jì)數(shù)的前提下，能夠促進(jìn)霉菌和酵母菌的生長，2-oas可用于制備霉菌和酵母菌的生長促進(jìn)劑。

18、作為可選的，本發(fā)明還提出2-氧代丙酸鈉鹽(2-oas)的另一種新應(yīng)用，包括：

19、2-oas可作為生長助劑和熒光增效劑為水凝膠基載體gg@2-oas@kgm所負(fù)載的微生物賦予可視化的熒光和可見光的特性，2-oas可作為霉菌和酵母菌熒光和可見光可視化檢測方法中顯色增效劑。

20、進(jìn)一步的，在水凝膠基載體gg@2-oas@kgm中，2-oas的占比為10～90％時，與顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽鈉鹽和十六碳酸4-硝基苯酯協(xié)同作用對霉菌和酵母菌菌體具有可視化的熒光和可見光的顯色增效作用。當(dāng)2-oas占gg、kgm和2-oas總質(zhì)量的比為1:5(w/w)時，霉菌和酵母菌可見光下的可視化顯色明顯，365nm波長下的可視化熒光檢測抗背景干擾能力強(qiáng)，熒光和可見光的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果與國標(biāo)gb4789.15-2016中描述的瓊脂平板計(jì)數(shù)法結(jié)果無顯著性差異(p＞0.05)。

21、本發(fā)明的有益效果：

22、天然水凝膠瓜爾膠和魔芋膠對霉菌和酵母菌具有較好的生物相容性，而2-氧代丙酸鈉通常作為緩沖劑或賦形劑。在本發(fā)明提供的一種水凝膠基的活性微生物載體中，第一，2-氧代丙酸鈉可作為瓜爾膠和魔芋膠的小分子交聯(lián)劑，用于提高天然瓜爾膠和魔芋膠體系的機(jī)械性能和凝膠特性，增加水凝膠在28℃恒溫條件下的穩(wěn)定性；第二，由于2-氧代丙酸鈉具有抗自由基抗氧化還原作用，因此可作為霉菌和酵母菌在水凝膠體系的立體微空間中的孢子生長助劑，維持或提高霉菌和酵母菌生長的穩(wěn)定性；第三，2-氧代丙酸鈉可作為霉菌和酵母菌菌體可視化熒光顯色增效劑，因底物經(jīng)酶解后顯色基團(tuán)游離，其中游離出的吲哚酚基團(tuán)在氧的存在下形成藍(lán)色或藍(lán)紫色的吲哚酚二聚體，但此二聚體無熒光特性，而2-氧代丙酸鈉能夠作為該吲哚酚二聚體的結(jié)構(gòu)修飾物，增加聚合物中的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，體系中π-π共軛效應(yīng)增強(qiáng)，聚合物結(jié)構(gòu)表面剛性增強(qiáng)，使得該聚合物可作為吲哚類熒光探針用于霉菌和酵母菌的可視化熒光檢測。本發(fā)明借助天然高分子鏈聚合物協(xié)同外源性小分子物質(zhì)設(shè)計(jì)的水凝膠基的活性微生物載體制備過程簡單、成本低、凝膠性能穩(wěn)定、生物相容好等特點(diǎn)，為基于微生物胞外酶刺激響應(yīng)的顯色水凝膠制備及應(yīng)用提供了新路徑。本發(fā)明提出的gg@2-oas@kgm水凝膠體系作為活性微生物載體用于霉菌和酵母菌的快速檢測方法，顯著縮短檢測時間，提高檢測效率和準(zhǔn)確性。