本發(fā)明屬于水凝膠，尤其涉及用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠及制備方法。

背景技術(shù)：

1、心血管疾病(cvd)是一類影響心臟和血管的疾病，包括冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、心力衰竭、心律失常、腦卒中等。截至目前，心血管疾病仍然是造成全球范圍內(nèi)死亡率高的主要原因之一，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了極大挑戰(zhàn)。而血管動(dòng)脈粥樣硬化(as)是導(dǎo)致多種心血管疾病的主要原因之一。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的一個(gè)關(guān)鍵病理過(guò)程，它通過(guò)影響血管的健康和功能，增加了心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。因此，預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病管理的重要方面。

2、動(dòng)脈粥樣硬化是指動(dòng)脈內(nèi)壁逐漸積累脂肪、膽固醇等物質(zhì)，形成斑塊(或稱為動(dòng)脈粥瘤)，導(dǎo)致血管變窄、硬化，進(jìn)而影響血流。其中，病變血管的鈣化導(dǎo)致血管局部變硬，而血管鈣化是一種病理過(guò)程，其中鈣鹽在血管壁內(nèi)沉積，導(dǎo)致血管壁硬化和增厚，從而減少血管的彈性。血管鈣化的病理生理特點(diǎn)包括血管壁的鈣化、斑塊形成、血管順應(yīng)性降低、血流受限和炎癥反應(yīng)等。由于血管鈣化的發(fā)病率相對(duì)較低，且血管鈣化的長(zhǎng)期影響和治療效果可能需要長(zhǎng)期跟蹤研究來(lái)評(píng)估，這大大增加了研究的復(fù)雜性和成本。

3、動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)的血管狹窄主要有三種治療方法，分別是藥物治療、擴(kuò)張血管介入治療以及外科手術(shù)治療。如1.藥物治療是血管狹窄的一種非侵入性治療方法。這些藥物可以通過(guò)減少血小板的凝聚、控制血壓和降低血脂水平等途徑來(lái)減輕血管狹窄的程度，改善癥狀，并預(yù)防進(jìn)一步的動(dòng)脈硬化。2.擴(kuò)張血管介入治療是一種通過(guò)在狹窄的血管內(nèi)放置支架或進(jìn)行血管成形術(shù)來(lái)恢復(fù)血流通暢的方法。常見的介入治療包括冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)、血管成形術(shù)、藥物洗脫等。這些方法可以通過(guò)擴(kuò)張狹窄的血管，使血流得以恢復(fù)和改善。3.外科手術(shù)治療：對(duì)于嚴(yán)重且無(wú)法通過(guò)藥物治療或介入治療改善的血管狹窄病例，可能需要進(jìn)行外科手術(shù)治療，包括血管旁路手術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜刮除術(shù)、血管重建手術(shù)等。其中，擴(kuò)張血管介入治療方法作為主要治療手段之一，由于支架介入治療的廣泛應(yīng)用，支架內(nèi)再狹窄已成為一個(gè)突出的臨床問(wèn)題。目前，藥物洗脫支架(des)通過(guò)局部的藥物作用，能夠降低早期支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率，被用來(lái)替代金屬支架。但是，臨床研究顯示，des導(dǎo)致血管再內(nèi)皮化延遲而引發(fā)的晚期支架內(nèi)再狹窄仍是一個(gè)亟待解決的重要臨床問(wèn)題。藥物洗脫支架在控制支架植入后血管壁彈性回縮的同時(shí)，通過(guò)緩慢釋放涂層中所攜帶的藥物，達(dá)到降低血管內(nèi)膜過(guò)度增生的效果。早期des所攜帶的藥物(如西羅莫司或紫杉醇)可抑制平滑肌細(xì)胞增生和遷移，但同時(shí)也抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，易造成支架植入局部的再內(nèi)皮化進(jìn)程延遲，進(jìn)而易引起支架內(nèi)斑塊等不良事件的發(fā)生，被認(rèn)為是植入支架后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，限制其治療效果。第二代藥物洗脫支架開始重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)皮修復(fù)問(wèn)題，希望采用新的藥物成分(如雷帕霉素的衍生物依維莫司)選擇性地抑制平滑肌細(xì)胞增殖，不傷及內(nèi)皮細(xì)胞。這雖然是目前的研究熱點(diǎn)，但是否真正有效，還有待觀察。

4、在心血管疾病的研究方面，生化信號(hào)被廣泛研究，可是關(guān)于脈管系統(tǒng)本身的物理信號(hào)的作用的研究卻不多。脈管系統(tǒng)中主要存在三種機(jī)械力，有血流剪切應(yīng)力、中膜和外膜的周向應(yīng)力以及血管內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)之間的軸向應(yīng)力，對(duì)血管動(dòng)脈粥樣硬化的病變過(guò)程都產(chǎn)生著巨大的影響。并且越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，隨著血管剛度的增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)之間的軸向應(yīng)力在動(dòng)脈粥樣硬化行為的早期和發(fā)展過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙可以改變血管穩(wěn)態(tài)、血栓形成、血管張力和炎癥反應(yīng)等，但目前基底剛度介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙的分子機(jī)制尚不清楚。但后來(lái)隨著生物力學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多研究表明，血管基質(zhì)剛度可以參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和擴(kuò)散等生物學(xué)行為，與動(dòng)脈粥樣硬化的程度密切相關(guān)，并且血管壁硬化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)的影響更大，但是機(jī)制尚不清楚。因此，深入探索血管基底硬度在動(dòng)脈粥樣硬化中的重要作用，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要作用。

5、同時(shí)期，很多聚丙烯酰胺(pa)水凝膠也已被用于研究血管動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，但是鮮有較成熟的血管模型用于上述研究?，F(xiàn)有技術(shù)中，使用高分子水凝膠(如聚丙烯酰胺和透明質(zhì)酸等)制備血管基底模型，雖然可以模擬血管的吸水性、彈性及生物相容性等，但卻無(wú)法更好的模擬血管病變斑塊的硬度特征，又難以精確控制水凝膠的力學(xué)性能和孔隙結(jié)構(gòu)，制備難度大、成本高并且存在再現(xiàn)性難題，故不能更好的應(yīng)用于血管硬化等心血管疾病的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠及其制備方法，能夠在生物醫(yī)學(xué)類實(shí)驗(yàn)室完成制備，滿足所用試劑和耗材對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性、水凝膠材料剛度呈梯度、水凝膠材料剛度梯度呈線性、制備水凝膠材料可重現(xiàn)，且批次間差異小、制備過(guò)程無(wú)需大型設(shè)備等條件。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的技術(shù)方案之一：

4、本發(fā)明提供一種用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠，其由丙烯酰胺以及n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺構(gòu)成，所述n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度沿同一方向呈梯度均勻分布。

5、優(yōu)選地，所述用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠作為一個(gè)整體結(jié)構(gòu)，梯度剛度區(qū)間在10～90kpa之間，沿同一方向呈線性趨勢(shì)由低剛度逐漸增加至高剛度，梯度強(qiáng)度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行調(diào)整(如1kpa/mm)。

6、本發(fā)明的技術(shù)方案之二：

7、本發(fā)明提供一種所述的用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

8、將丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺和過(guò)硫酸銨分別制備成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液；

9、將丙烯酰胺溶液、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶液和去離子水混勻，再加入過(guò)硫酸銨溶液與共引發(fā)劑催化該反應(yīng)，磁力攪拌至混合均勻，得到混合溶液；

10、采用雙注射法將所述混合溶液與n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶液分別以一定速率同時(shí)注入模具內(nèi)，靜置后即可得到所述用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠；

11、所述混合溶液與n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶液的注射速率分別為300～450ml/h和30～100ml/h，優(yōu)選為370ml/h和37ml/h，速率可以根據(jù)梯度強(qiáng)度而調(diào)整。

12、優(yōu)選地，將丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺和過(guò)硫酸銨分別制備成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，具體指的是：將丙烯酰胺溶于去離子水中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％的丙烯酰胺溶液；將n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶于去離子水中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶液；將過(guò)硫酸銨溶于去離子水中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的過(guò)硫酸銨溶液。

13、優(yōu)選地，所述共引發(fā)劑為n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(temed)。

14、優(yōu)選地，所述丙烯酰胺和n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺的質(zhì)量的比值為0.5～1.5。

15、優(yōu)選地，所述過(guò)硫酸銨與丙烯酰胺的質(zhì)量的比值為0.02～0.05；所述共引發(fā)劑與丙烯酰胺的質(zhì)量的比值為0.002～0.005。

16、優(yōu)選地，本發(fā)明采用多孔注射針頭注射所述混合溶液，可以更好地對(duì)所制備水凝膠的大小進(jìn)行調(diào)整。

17、優(yōu)選地，所述靜置時(shí)間為8～10min。

18、優(yōu)選地，所述雙注射法的裝置包括：注射泵①、合液器②、蠕動(dòng)泵③、空氣檢測(cè)裝置④、過(guò)濾裝置⑤、xyz絲桿滑臺(tái)線性模組工作臺(tái)⑥以及多孔注射針頭⑦；

19、注射泵①中含有注射器，所述注射器與合液器②兩端中的一端相連接，用于將注射器中液體按既定速度注射入合液器②中，所述注射泵①用于注射n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶液；

20、合液器②，利用磁力攪拌作用將溶液混合并使其均勻；

21、蠕動(dòng)泵③，按照液體流動(dòng)方向?qū)⑵湮胍后w一端與合液器②兩端中的另一端相連接，流出液體的方向與過(guò)濾裝置⑤連接，所述蠕動(dòng)泵③用于輸送混合溶液；

22、空氣檢測(cè)裝置④，放置于蠕動(dòng)泵③吸入液體的連接導(dǎo)管上，用于檢測(cè)溶液在流動(dòng)過(guò)程中的氣泡，提前進(jìn)行干預(yù)，以保證后續(xù)梯度溶液均勻；

23、過(guò)濾裝置⑤，與蠕動(dòng)泵③流出液體的導(dǎo)管相連接，用于過(guò)濾溶液中的細(xì)菌、病毒以及其他微小的雜質(zhì)，使最終制得的水凝膠無(wú)菌，利于培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；

24、xyz絲桿滑臺(tái)線性模組工作臺(tái)⑥，與過(guò)濾裝置⑤相連接，用于代替實(shí)驗(yàn)人員手動(dòng)制膠，提高梯度溶液均勻性和可重復(fù)性。

25、多孔注射針頭⑦，與xyz絲桿滑臺(tái)線性模組工作臺(tái)⑥相連接，用于將液體注入模具。

26、水凝膠是一種三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物，具有許多獨(dú)特的特點(diǎn)，如吸水性：水凝膠能夠吸收并保持大量的水分，這是由于它們的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠與水分子形成氫鍵；可調(diào)節(jié)的理化性質(zhì)：通過(guò)改變水凝膠的化學(xué)組成、交聯(lián)密度、ph值等，可以調(diào)節(jié)其物理和化學(xué)性質(zhì)，如彈性、溶脹率、降解速率等。水凝膠在醫(yī)療、工業(yè)、環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，比如傷口敷料、隱形眼鏡、乳化劑、密封劑等。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，水凝膠的潛在性能和應(yīng)用領(lǐng)域還將繼續(xù)擴(kuò)展。線性梯度水凝膠技術(shù)是一種制備具有線性梯度結(jié)構(gòu)水凝膠的技術(shù)，這種技術(shù)可以模擬生物組織中的部分梯度結(jié)構(gòu)，從而更好地模擬生物組織的力學(xué)和生物學(xué)特性。使用線性梯度剛度材料模擬病變血管，可以幫助研究人員更好地理解血管病變過(guò)程中的力學(xué)行為和生物力學(xué)特性。通過(guò)模擬，研究人員可以觀察在不同病變階段血管的響應(yīng)，從而為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供重要的科學(xué)依據(jù)。

27、線性梯度剛度水凝膠是一種具有梯度剛度特性的材料，它可以模擬人體組織中不同區(qū)域的剛度變化。目前，制備梯度剛度基質(zhì)膠的方法有多種，但每種方法都有其適用的場(chǎng)景和限制。例如物理混合法，操作簡(jiǎn)單，但難以精確控制剛度梯度；光交聯(lián)梯度法，可實(shí)現(xiàn)剛度的梯度變化，但光交聯(lián)對(duì)環(huán)境因素較為敏感。梯度剛度基質(zhì)膠的制備方法通常比較復(fù)雜，并且面臨再現(xiàn)性問(wèn)題，若要制得理想的基質(zhì)膠，需要精確控制凝膠的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等條件。所以，如何優(yōu)化梯度剛度水凝膠的制備方法，以提高其實(shí)際性能和可靠性，使其能夠準(zhǔn)確模擬病變血管仍是目前面臨的一個(gè)問(wèn)題。之所以現(xiàn)在沒(méi)有較成熟的血管模型用于研究血管動(dòng)脈粥樣硬化，是因?yàn)槠潆y點(diǎn)在于發(fā)生粥樣硬化病變的血管具有梯度剛度，其梯度區(qū)間大約為10～80kpa。因此，本發(fā)明利用線性梯度水凝膠技術(shù)制備出具有線性梯度剛度特性的水凝膠材料，可以為研究人員提供用于研究的血管模型，滿足研究需求，進(jìn)而為動(dòng)脈粥樣硬化的疾病治療提供新的可能性。

28、本發(fā)明的技術(shù)方案之三：

29、本發(fā)明還提供所述的線性梯度剛度水凝膠在非疾病診斷目的的模擬粥樣硬化血管中的應(yīng)用。

30、本發(fā)明的技術(shù)方案之四：

31、本發(fā)明還提供一種由所述的線性梯度剛度水凝膠制備得到的粥樣硬化血管模型。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

33、此前，有基于二次交聯(lián)的凝膠基微流控芯片制造的方法，能構(gòu)造具有不同復(fù)雜內(nèi)部流道的凝膠芯片，進(jìn)而接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成具有血管形態(tài)和功能的血管模型。本發(fā)明中與之區(qū)別的地方在于，本發(fā)明提供了一種用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠及其制備方法，可直接制備出具有線性梯度剛度特性的水凝膠來(lái)模擬病變狀態(tài)下的動(dòng)脈粥樣硬化血管，能提供一個(gè)更加直觀的平臺(tái)，用于研究動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展和治療策略。并且相對(duì)于微流控模型，該模型的構(gòu)建和操作相對(duì)簡(jiǎn)單且成本較低。

34、本發(fā)明提供了一種用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度水凝膠及制備方法。本發(fā)明中線性梯度剛度水凝膠作為一個(gè)整體結(jié)構(gòu)，梯度剛度區(qū)間在10～90kpa之間，沿同一方向呈線性趨勢(shì)由低剛度逐漸增加至高剛度，能很好的模擬粥樣硬化病變血管的特征，可以成為供研究人員用于研究的血管模型，為動(dòng)脈粥樣硬化疾病的治療提供更多新的可能。并且本發(fā)明的制備方法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)成本低、再現(xiàn)性強(qiáng)，適用于制作不同尺寸的用于模擬粥樣硬化血管的線性梯度剛度基質(zhì)膠，并且該水凝膠滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)條件，有利于細(xì)胞力學(xué)方面的相關(guān)研究。

35、本發(fā)明提供的線性梯度剛度水凝膠制備過(guò)程中采用雙注射法制備梯度溶液：雙注射法能夠通過(guò)精確控制微量注射儀器的注射速率以及混合梯度溶液中每種成分的濃度和比例，產(chǎn)生線性梯度，達(dá)到更好的分離效果，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。通過(guò)設(shè)置水凝膠材料的始末剛度，即可通過(guò)雙注射法制備得到具有單向線性梯度剛度的水凝膠。除此之外，雙注射法可以精確控制每次注射的體積，從而減少樣品的損耗，且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低。該水凝膠制備體系中還設(shè)置有過(guò)濾器等裝置，且操作無(wú)菌，更加滿足后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的條件。