本發(fā)明涉及魚類分子育種，尤其涉及一種檢測(cè)大口黑鱸基因組中snp位點(diǎn)的試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大口黑鱸(micropterus?salmoides)，又名加州鱸，是重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。大口黑鱸蛙虹彩病毒(largemouth?bass?ranavirus,lmbv)感染引起的病毒病危害嚴(yán)重，致死率可達(dá)100％，目前尚無(wú)有效的治療方案，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，成為制約大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問(wèn)題?？共∥稽c(diǎn)的定位研究和高抗病群體的選育成為大口黑鱸人工養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的重要策略。

2、全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome?wide?association?study，gwas)是對(duì)多個(gè)個(gè)體在全基因組范圍內(nèi)的遺傳變異(標(biāo)記)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，獲得基因型，進(jìn)而將基因型與可觀測(cè)的性狀即表型，進(jìn)行群體水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)量或顯著性p值篩選出最有可能影響該性狀的遺傳變異(標(biāo)記)，然后利用標(biāo)記與功能基因的連鎖不平衡關(guān)系，挖掘與性狀變異相關(guān)的基因的過(guò)程。gwas關(guān)聯(lián)精度高，研究周期短，已成為功能基因挖掘的重要手段。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得高密度的遺傳標(biāo)記已經(jīng)成為標(biāo)記開(kāi)發(fā)的主流，人們基于高通量分型技術(shù)，結(jié)合gwas方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定了大量與復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳變異，極大地促進(jìn)了遺傳學(xué)的發(fā)展。

3、目前已有科研人員篩選出大口黑鱸與彈狀病毒抗性相關(guān)的snp位點(diǎn)，但缺乏大口黑鱸對(duì)蛙虹彩病毒抗性性狀相關(guān)snp位點(diǎn)的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種特異性檢測(cè)大口黑鱸基因組中snp位點(diǎn)的試劑及其應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)大口黑鱸基因組中snp位點(diǎn)的試劑，所述試劑用于檢測(cè)snp位點(diǎn)1、snp位點(diǎn)2和snp位點(diǎn)3的基因型；

4、所述snp位點(diǎn)1位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38928188處，

5、所述snp位點(diǎn)2位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38930790處，

6、所述snp位點(diǎn)3位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38943374處，

7、所述大口黑鱸基因組的genbank登錄號(hào)為：asm1485139v1。

8、本發(fā)明確定出了與大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(snp)，通過(guò)檢測(cè)snp位點(diǎn)的基因型，即可得到大口黑鱸抗蛙虹彩病毒的性狀。

9、在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述試劑包括引物組；

10、檢測(cè)snp位點(diǎn)1的引物組的核苷酸序列如seq?id?no：1～3所示；

11、檢測(cè)snp位點(diǎn)2的引物組的核苷酸序列如seq?id?no：4～6所示；

12、檢測(cè)snp位點(diǎn)3的引物組的核苷酸序列如seq?id?no：7～9所示。

13、第二方面，本發(fā)明提供了所述試劑在鑒別大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀中的應(yīng)用。

14、第三方面，本發(fā)明提供了所述試劑在制備鑒別大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀的試劑盒中的應(yīng)用。

15、第四方面，本發(fā)明提供了所述試劑在大口黑鱸育種中的應(yīng)用。

16、第五方面，本發(fā)明提供了一種鑒別大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀的方法，檢測(cè)待測(cè)大口黑鱸的snp位點(diǎn)1、snp位點(diǎn)2和snp位點(diǎn)3的基因型；

17、所述snp位點(diǎn)1位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38928188處，

18、所述snp位點(diǎn)2位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38930790處，

19、所述snp位點(diǎn)3位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38943374處，

20、所述大口黑鱸基因組的genbank登錄號(hào)為：asm1485139v1；

21、所述snp位點(diǎn)1基因型為gg的樣本對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于gt和tt基因型的樣本；

22、所述snp位點(diǎn)2基因型為cc的樣本對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于gg和gc基因型的樣本；

23、所述snp位點(diǎn)3基因型為cc的樣本對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于aa和ac基因型的樣本。

24、在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，用所述試劑進(jìn)行檢測(cè)。

25、進(jìn)一步地，所述方法為pcr擴(kuò)增。

26、第六方面，本發(fā)明提供了一種鑒別大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀的試劑盒，所述試劑盒中含有所述試劑。

27、在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述試劑盒還含有flu-arms?2×pcr?mix和水。

28、以待測(cè)大口黑鱸基因組dna為dna模板，以核苷酸序列為seq?id?no：1～3、seq?idno：4～6和seq?id?no：7～9所示的引物，分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物中待測(cè)大口黑鱸snp位點(diǎn)1～3的基因型，判斷待測(cè)大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀。

29、pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10min；95℃15s，61～55℃梯度退火60s(-0.6℃/循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.6℃)，10個(gè)循環(huán)；95℃15s，55℃60s，共30個(gè)循環(huán)；30℃30s。

30、pcr擴(kuò)增體系(總體積10μl)為：dna模板5ng～250ng，flu-arms?2×pcr?mix?5.0μl，上游分型引物f1(10μm)0.05μl～0.25μl、下游分型引物f2(10μm)0.05μl～0.25μl，下游通用引物r(10μm)0.1μl～0.5μl，補(bǔ)ddh2o至10μl。

31、優(yōu)選pcr擴(kuò)增體系(總體積10μl)為：dna模板5ng～50ng、flu-arms?2×pcr?mix5.0μl、上游分型引物f1(10μm)0.1μl、下游分型引物f2(10μm)0.1μl、下游通用引物r(10μm)0.3μl，補(bǔ)ddh2o至10μl。

32、核苷酸序列如seq?id?no：1～3所示的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物(命名為擴(kuò)增產(chǎn)物1)如seqid?no：13所示；核苷酸序列如seq?id?no：4～6所示的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物(命名為擴(kuò)增產(chǎn)物2)如seq?id?no：14所示；核苷酸序列如seq?id?no：7～9所示的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物(命名為擴(kuò)增產(chǎn)物3)如seq?id?no：15所示。

33、snp位點(diǎn)1位于擴(kuò)增產(chǎn)物1的5’端的第25bp(即genbank登錄號(hào)：asm1485139v1的參考大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38928188處)時(shí)，gg基因型的大口黑鱸樣本對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于gt和tt基因型，感染蛙虹彩病毒后存活時(shí)間長(zhǎng)。

34、snp位點(diǎn)2位于擴(kuò)增產(chǎn)物2的5’端的第25bp(即genbank登錄號(hào)：asm1485139v1的參考大口黑鱸3號(hào)染色體的g?38930790處)時(shí)，cc基因型的大口黑鱸樣本對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于gg和gc基因型，感染蛙虹彩病毒后存活時(shí)間長(zhǎng)。

35、snp位點(diǎn)3位于擴(kuò)增產(chǎn)物3的5’端的第25bp(即genbank登錄號(hào)：asm1485139v1的參考大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38943374處)時(shí)，cc基因型的大口黑鱸樣本對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于aa和ac基因型，感染蛙虹彩病毒后存活時(shí)間長(zhǎng)。

36、第七方面，本發(fā)明提供了一種大口黑鱸育種方法，檢測(cè)大口黑鱸的snp位點(diǎn)1、snp位點(diǎn)2和snp位點(diǎn)3的基因型，得到所述snp位點(diǎn)1基因型為gg、snp位點(diǎn)2基因型為cc和snp位點(diǎn)3基因型為cc的大口黑鱸，作為親本，對(duì)所述親本進(jìn)行繁育，得到抗蛙虹彩病毒的大口黑鱸品種；

37、所述snp位點(diǎn)1位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38928188處，

38、所述snp位點(diǎn)2位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38930790處，

39、所述snp位點(diǎn)3位于大口黑鱸基因組3號(hào)染色體的g?38943374處，

40、所述大口黑鱸基因組的genbank登錄號(hào)為：asm1485139v1。

41、進(jìn)一步地，用所述試劑或所述試劑盒檢測(cè)大口黑鱸的snp位點(diǎn)1、snp位點(diǎn)2和snp位點(diǎn)3的基因型。

42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

43、本發(fā)明通過(guò)gwas篩選到3個(gè)與大口黑鱸抗蛙虹彩病毒性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(snp)，snp位點(diǎn)分別為大口黑鱸3號(hào)染色體上的g?38928188g>t位點(diǎn)、g?38930790c>g位點(diǎn)和g?38943374c>a位點(diǎn)，snp1的gg基因型、snp2的cc基因型和snp3的cc基因型的大口黑鱸對(duì)蛙虹彩病毒的抗性顯著高于其他基因型的個(gè)體。通過(guò)檢測(cè)snp1、snp2和snp3位點(diǎn)的基因型，有效確定待測(cè)大口黑鱸對(duì)蛙虹彩病毒的抗性，為進(jìn)一步研究大口黑鱸蛙虹彩病毒抗性遺傳結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)，為抗病育種提供了有價(jià)值的信息。