本發(fā)明涉及基因突變檢測，尤其涉及檢測酒精代謝能力有關(guān)的人基因突變的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
1、酒精(乙醇)在人體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝。乙醇進(jìn)入人體后，經(jīng)乙醇脫氫酶的作用，被分解為乙醛，再經(jīng)乙醛脫氫酶的作用，轉(zhuǎn)換成乙酸后再分解為水和二氧化碳排出體外。其中乙醛對人體有害，會刺激神經(jīng)，被世界衛(wèi)生組織列為一級致癌物；如果不能及時被分解掉，就會在體內(nèi)積累從而產(chǎn)生臉紅、頭暈、嘔吐等醉酒現(xiàn)象甚至威脅生命。乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶是人體中重要的代謝酶之一，分別由adh1b和aldh2基因編碼生成。如adh1b和aldh2基因序列發(fā)生突變，如堿基缺失、堿基插入和單堿基突變等，就可能造成其編碼的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶活性降低或者無活性，從而影響乙醇在體內(nèi)的代謝分解能力。對于東亞和漢族人群，adh1b最常見的突變位點為rs1229984(t/c)，其在東亞人群中的出現(xiàn)頻率分別為t(70.45％)、c(29.58％)；aldh2最常見的突變位點為rs671(g/a)，其在東亞人群中的出現(xiàn)頻率分別為g(77.53％)、a(22.47％)。adh1b?rs1229984位點根據(jù)堿基的類型可分為純合子tt型、純合子cc型、雜合子tc型共3種基因型，研究顯示tt型為正常代謝型，即乙醇脫氫酶的活性正常；tc型的乙醇脫氫酶的活性略有降低，為中間代謝型；cc型的乙醇脫氫酶的活性較弱，為慢代謝型，其對乙醇的代謝能力較弱。aldh2?rs671位點根據(jù)堿基的類型可分為純合子gg型、純合子aa型、雜合子ga型共3種基因型，研究顯示gg型為正常代謝型，即乙醛脫氫酶的活性為100％；ga型的乙醛脫氫酶的活性降低，但仍具有13％～14％的活性，為中間代謝型；aa型的乙醛脫氫酶的活性最弱，僅為2％左右，為慢代謝型，乙醛的代謝能力弱。
2、目前，市面上已有的針對adh1b?rs1229984或aldh2?rs671位點堿基突變檢測常用的方法包括測序法、pcr溶解曲線法、pcr毛細(xì)管電泳法和熒光pcr法等。
3、熒光pcr技術(shù)是目前分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的一種檢測技術(shù)，因其檢測靈敏度高、特異性強而被廣泛應(yīng)用于病原體檢測、腫瘤早篩、食品檢測等諸多領(lǐng)域。其核心原理為pcr擴增和熒光信號檢測，其中pcr擴增過程模擬了生物體內(nèi)dna半保留復(fù)制過程，在生物酶、dntps、金屬離子等物質(zhì)存在的條件下，以與靶基因核酸序列互補配對的引物為向?qū)Ш铣尚碌暮怂崞危浞磻?yīng)條件包括變性、退火和延伸三個過程。熒光信號通過在一段與靶標(biāo)序列互補且5’端和3’端分別標(biāo)記報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針來實現(xiàn)檢測。常見的探針包括最常用的taqman探針、分子信標(biāo)探針、蝎型探針、mgb探針等，不同類型的探針應(yīng)用的具體檢測領(lǐng)域不一樣。
4、其中，分子信標(biāo)探針由于其特異性相比于taqman探針更強，是目前用于酒精代謝相關(guān)基因或其他基因單堿基突變檢測最常用的檢測探針。分子信標(biāo)是一種常規(guī)狀態(tài)下自身能夠形成一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。其5’端(標(biāo)記有發(fā)光基團(tuán))和3’端(標(biāo)記有淬滅基團(tuán))部分堿基能夠互補配對形成一段莖干結(jié)構(gòu)，中間段則形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其在自然狀態(tài)下形成比較穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢在于：a)特異性強，相比于普通的taqman探針，其對于單個堿基的錯配、缺失或插入突變均能檢測出來；b)背景信號低，由于其莖干結(jié)構(gòu)，使其5’段的反光基團(tuán)和3’段的淬滅基團(tuán)在空間上距離更短，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)更強，使得其檢測的背景信號更低，信噪比更強。
5、1)現(xiàn)有的熒光pcr產(chǎn)品由于其核心原料taq酶延伸速度低，約為1kb/分鐘，對于產(chǎn)物長度為200bp～300bp左右的pcr擴增，至少需要設(shè)定15秒以上的延伸時間，且由于pcr反應(yīng)的復(fù)雜性及讀熒光時間一般需要更長的30秒或以上；
6、2)現(xiàn)有的熒光pcr產(chǎn)品使用的是基本上都是普通的pcr儀平臺，其升降溫速度僅為2.5℃/秒左右，使得每個循環(huán)的變性-退火/延伸(以95℃變性，60℃退火/延伸為例)的時間消耗接近30秒，40個循環(huán)的總升降溫時間接近20分鐘；
7、3)現(xiàn)有的熒光pcr產(chǎn)品大多采用分子信標(biāo)探針，探針設(shè)計復(fù)雜、要求高，如不滿足要求反而容易導(dǎo)致非特異性信號的產(chǎn)生；。
8、4)現(xiàn)有的產(chǎn)品采用的主要為全血樣本類型，其采樣過程相對復(fù)雜，且需要高度專業(yè)的技術(shù)人員操作；由于全血樣本的復(fù)雜性，使其在用于后續(xù)pcr檢測時需要經(jīng)過復(fù)雜的核酸提取過程，費時、費力。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，而提出的檢測酒精代謝能力有關(guān)的人基因突變的試劑盒及檢測方法。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
3、檢測酒精代謝能力有關(guān)的人基因突變的試劑盒，包括：核酸釋放劑和pcr反應(yīng)液；
4、所述核酸釋放劑組成成分包括：10～20mm的tris、20～100mm的nacl、2～10mm的edta、0.1～1％?sds(w/v)、5～20mg/ml的蛋白酶k、0.005～0.02％的tritonx-100(v/v)；；
5、所述pcr反應(yīng)液包括：rs1229984位點特異性引物、rs671位點特異性探針、0.05～0.4u/μl快速taq酶、與taq酶配套的pcr?buffer、0.01～0.02u/μl的udg酶。
6、優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)液中，包括0.2～0.8μm的rs1229984位點特異性引物、0.1～0.4μmrs671位點特異性探針。
7、優(yōu)選的，所述rs1229984位點特異性引物包括：
8、上游引物5’-tcaccaggttgccactaacca-3’；
9、下游引物5’-acacaatttcaggaatttgggtatg-3’；
10、探針1?5’-tctgtgcgacagat-3’；
11、探針2?5’-tctgtgtgacagat-3’。
12、優(yōu)選的，所述rs671位點特異性引物包括：
13、上游引物5’-gggagttgggcgagtacg-3’；
14、下游引物5’-agaccctcaagccccaacag-3’；
15、探針1?5’-tacactgaagtgaa-3’；
16、探針2?5’-tacactaaagtgaa-3’。
17、優(yōu)選的，所述探針5’端均標(biāo)記有fam/vi?c/rox/cy5發(fā)光基團(tuán)中的一種，3’端均連接有mgb基團(tuán)，5’-3’端起第7個堿基(即檢測的突變位點堿基)均進(jìn)行l(wèi)na修飾。
18、檢測酒精代謝能力有關(guān)的人基因突變的檢測方法，采用檢測酒精代謝能力有關(guān)的人基因突變的試劑盒，包括以下步驟：
19、a)用無菌拭子拭取咽部分泌物，將拭子頭浸入核酸釋放劑中；
20、b)取pcr反應(yīng)液按15μl/管分裝至pcr反應(yīng)管中；
21、c)吸取5μl步驟a)中的核酸釋放劑加入到上述分裝有pcr反應(yīng)液的反應(yīng)管中，混勻離心；
22、d)在熒光pcr儀上進(jìn)行上機檢測，反應(yīng)程序設(shè)置為：①95℃～98℃30秒～2分鐘；②98℃0～2秒，60℃2～5秒(讀熒光：fam/vic/rox/cy5)，40～45個循環(huán)；
23、e)pcr擴增結(jié)束后，使用熒光pcr儀的分析軟件對待測樣本的結(jié)果進(jìn)行分析，通過fam/vic/rox/cy5通道的檢測熒光信號值來判定實驗有效性和樣本的基因型。
24、優(yōu)選的，所述步驟d)中，在熒光pcr儀上進(jìn)行上機檢測時，反應(yīng)程序設(shè)置為：①95℃30秒；②98℃1秒，60℃2秒(讀熒光：fam/vic/rox/cy5)，40個循環(huán)
25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
26、1)本發(fā)明以人咽拭子作為檢測樣本，采樣簡單、快速，同時相比于全血樣本復(fù)雜的成分，咽拭子樣本中成分簡單，使其經(jīng)核酸釋放劑釋放核酸后即可進(jìn)行后續(xù)擴增檢測，無需進(jìn)行繁瑣的提取純化過程；
27、2)本發(fā)明采用改進(jìn)后的快速taq酶作為核心原料，配合快速熒光pcr儀可實現(xiàn)10分鐘以內(nèi)的全流程檢測，檢測時間短，應(yīng)用效率更高；
28、3)本發(fā)明基于lna+mgb探針的熒光pcr法原理，設(shè)計更簡單，對單堿基突變(snp)檢測的特異性更高。