本發(fā)明涉及生物，尤其是涉及一種體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系、含其的體外轉(zhuǎn)錄溶液及用其體外轉(zhuǎn)錄的方法。

背景技術(shù)：

1、隨著新冠病毒的爆發(fā)與蔓延，研發(fā)周期短、生物安全性高的mrna疫苗受到了各大研究機(jī)構(gòu)和制藥公司的青睞。mrna疫苗是將含有編碼抗原蛋白的mrna導(dǎo)入人體，直接進(jìn)行翻譯以生成相應(yīng)的抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防免疫的作用。mrna疫苗的生產(chǎn)過程主要包括質(zhì)粒原液的制備、mrna原液的制備與純化、mrna疫苗制劑的生產(chǎn)等步驟。其中，mrna原液制備過程直接影響mrna疫苗的質(zhì)量和生產(chǎn)成本，因此優(yōu)化mrna原液的生產(chǎn)工藝十分重要。mrna原液的生產(chǎn)過程始于大量生產(chǎn)擴(kuò)增質(zhì)粒dna(pdna)，以線性化質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒的pcr產(chǎn)物為模板，利用t7、t3或sp6噬菌體聚合酶等rna聚合酶轉(zhuǎn)錄mrna，在dnase?i酶降解模板及純化后，通過在5′端加上帽子結(jié)構(gòu)以及在3′端加上ploya結(jié)構(gòu)以加強(qiáng)mrna的穩(wěn)定性。

2、迄今為止，大規(guī)模的加帽方式主要有兩種，分別為兩步法酶法加帽和一步法共轉(zhuǎn)錄加帽。酶法加帽是最為傳統(tǒng)的加帽方式，這種加帽方式幾乎可以達(dá)到100％的加帽率，但是加帽酶比較昂貴，需要的酶促成本高，批量生產(chǎn)成本高。另外，該方法還引入了額外的蛋白和s-腺苷甲硫氨酸(sam)，需進(jìn)行多次純化，工藝流程繁瑣。而一步法共轉(zhuǎn)錄加帽雖具有工藝簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但加帽效率較低。

3、因此，我們必須改進(jìn)現(xiàn)有的體外轉(zhuǎn)錄(in?vitro?transcription,ivt)mrna的生產(chǎn)方案，在提高加帽效率的同時(shí)降低mrna的生產(chǎn)成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有體外轉(zhuǎn)錄的加帽方式中，兩步法存在加帽酶比較昂貴、需要的酶促成本高和工藝流程繁瑣的問題，一步法存在加帽效率較低的問題，為解決上述問題，本發(fā)明提供一種體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系、含其的體外轉(zhuǎn)錄溶液及用其體外轉(zhuǎn)錄的方法。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系，所述體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系包含如下濃度的組分：

4、

5、在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系包含如下濃度的組分：

6、

7、在本發(fā)明一些任選技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)錄緩沖體系還包含50-100mm二硫蘇糖醇；和/或，所述轉(zhuǎn)錄緩沖液中，所述二價(jià)金屬離子為mg2+。

8、在本發(fā)明一些優(yōu)選技術(shù)方案中，mg2+以乙酸鎂、氯化鎂或硫酸鎂的方式添加；二硫蘇糖醇的濃度為50mm或100mm；tris-hcl的濃度為400mm；triton?x-100的濃度為0.02％。

9、在本發(fā)明一些更優(yōu)選技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)錄緩沖液的組分選自以下任意一組：

10、

11、

12、本發(fā)明第二方面提供了一種體外轉(zhuǎn)錄溶液，所述體外轉(zhuǎn)錄溶液包括第一溶液和第二溶液；任選地，還包括轉(zhuǎn)錄模板，優(yōu)選為線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄模板；所述第一溶液包含體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系、帽子類似物、鳥嘌呤核苷三磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、假尿嘧啶核苷三磷酸和rna聚合酶；所述第二溶液包含鳥嘧啶核苷三磷酸和假尿嘧啶核苷三磷酸。

13、在本發(fā)明一些優(yōu)選技術(shù)方案中，所述rna聚合酶為t7?rna聚合酶。

14、在本發(fā)明一些優(yōu)選技術(shù)方案中，所述體外緩沖體系為如本發(fā)明第一方面所述。

15、在本發(fā)明一些更優(yōu)選技術(shù)方案中，所述第一溶液中，所述體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系的起始濃度為10×；

16、所述帽子類似物的濃度為1-8mm；

17、鳥嘌呤核苷三磷酸的濃度為0.25mm-1.5mm；

18、腺嘌呤核苷三磷酸的濃度為9mm-11mm；

19、胞嘧啶核苷三磷酸的濃度為9mm-11mm；

20、假尿嘧啶核苷三磷酸的濃度為0.25mm-1.5mm；

21、所述線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄模板的濃度為5mm-20mm；

22、所述rna聚合酶的濃度為5mm-20mm；

23、和/或，所述第二溶液中，鳥嘌呤核苷三磷酸的濃度為8.5mm-9.75mm；假尿嘧啶核苷三磷酸的濃度為8.5mm-9.75mm。

24、在本發(fā)明一些具體技術(shù)方案中，所述第一溶液中，所述帽子類似物的濃度為1mm、3mm、6mm或8mm；

25、鳥嘌呤核苷三磷酸的濃度為0.25mm、0.5mm、1mm或1.5mm；

26、腺嘌呤核苷三磷酸的濃度為10mm；

27、胞嘧啶核苷三磷酸的濃度為10mm；

28、假尿嘧啶核苷三磷酸的濃度為0.25mm、0.5mm、1mm或1.5mm；

29、所述線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄模板的濃度為10mm；

30、所述rna聚合酶的濃度為10mm；

31、所述第二溶液中，鳥嘌呤核苷三磷酸的濃度為8.5mm、9mm、9.5mm或9.75mm；假尿嘧啶核苷三磷酸的濃度為為8.5mm、9mm、9.5mm或9.75mm。

32、在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述體外轉(zhuǎn)錄溶液中，第一溶液和第二溶液總的鳥嘌呤核苷三磷酸的濃度為8-12mm；總的假尿嘧啶核苷三磷酸的濃度為8-12mm。

33、在本發(fā)明一些具體方案中，所述第一溶液中，第一溶液和第二溶液總的鳥嘌呤核苷三磷酸的濃度為10mm；總的假尿嘧啶核苷三磷酸的濃度為10mm。

34、所述帽子類似物、鳥嘌呤核苷三磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、假尿嘧啶核苷三磷酸、線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄模板、rna聚合酶的濃度均為工作濃度。

35、本發(fā)明第三方面提供了體外轉(zhuǎn)錄溶液包括第一溶液和第二溶液，其中第二溶液用于在第一溶液反應(yīng)30分鐘后加入至第一溶液中；所述第一溶液包括體外轉(zhuǎn)錄緩沖液、帽子類似物、鳥嘌呤核苷三磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、假尿嘧啶核苷三磷酸、線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄模板、t7?rna聚合酶，余量為超純水；所述第二溶液由鳥嘌呤核苷三磷酸和假尿嘧啶核苷三磷酸組成。

36、可選地，本發(fā)明提供的體外轉(zhuǎn)錄溶液中的帽子類似物、鳥嘌呤核苷三磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、假尿嘧啶核苷三磷酸的起始濃度為各自為100毫摩爾每升(mm)。

37、可選地，以第一溶液的總體積為1000體積份計(jì)，所述帽子類似物的含量為10～20體積份。

38、可選地，以第一溶液的總體積為1000體積份計(jì)，第一溶液中的鳥嘌呤核苷三磷酸與第二溶液中的鳥嘌呤核苷三磷酸的體積和為80～120體積份。

39、可選地，以第一溶液的總體積為1000體積份計(jì)，第一溶液中的假尿嘧啶核苷三磷酸與第二溶液中的假尿嘧啶核苷三磷酸的體積和為80～120體積份。

40、可選地，以第一溶液的總體積為1000體積份計(jì)，第二溶液的體積為160～240體積份。

41、本發(fā)明第四方面提供了一種體外轉(zhuǎn)錄方法，使用上述任一技術(shù)方案所述的體外轉(zhuǎn)錄溶液進(jìn)行加帽反應(yīng)。

42、在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述第二溶液用于在所述第一溶液反應(yīng)后加入至所述第一溶液中。

43、在本發(fā)明一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述反應(yīng)的時(shí)間為5-60分鐘。

44、在本發(fā)明一些更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系為如本發(fā)明第一方面所述的體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系。

45、在本發(fā)明一些技術(shù)方案中，在所述加帽反應(yīng)中，先將所述第一溶液在34-39℃的環(huán)境下反應(yīng)0.5-1小時(shí)，再將所述第二溶液加入至所述第一溶液中，繼續(xù)反應(yīng)1.5～2小時(shí)；

46、可選地，在所述體外轉(zhuǎn)錄方法的加帽反應(yīng)中，先將第一溶液在37℃的環(huán)境下反應(yīng)0.5小時(shí)，再將第二溶液加入至第一溶液中，繼續(xù)反應(yīng)1.5～2小時(shí)。

47、在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，在所述體外轉(zhuǎn)錄方法的加帽反應(yīng)中，先將第一溶液在37℃的環(huán)境下反應(yīng)0.5小時(shí)，再將第二溶液加入至第一溶液中，繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)。

48、本發(fā)明第五方面提供了一種mrna體外轉(zhuǎn)錄的試劑盒，所述試劑盒包括如本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)錄緩沖體系或如本發(fā)明第二方面或第三發(fā)方面所述的體外轉(zhuǎn)錄溶液。

49、本發(fā)明第六方面提供了如本發(fā)明第一方面所述的體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系或如本發(fā)明第二方面或第三發(fā)方面所述的體外轉(zhuǎn)錄溶液在體外轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用。

50、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

51、本發(fā)明提供的體外轉(zhuǎn)錄緩沖體系、體外轉(zhuǎn)錄溶液及用其體外轉(zhuǎn)錄的方法，在保證高加帽率的同時(shí)能夠大幅降低帽子類似物的用量。