本發(fā)明涉及生物，尤其涉及用于提高藥物輸送能力的細(xì)胞外囊泡的制備方法。

背景技術(shù)：

1、口服給藥是首選的給藥途徑，由于胃腸道環(huán)境的影響(腸道屏障在營(yíng)養(yǎng)吸收和阻止有害物質(zhì)進(jìn)入人體內(nèi)循環(huán)方面具有重要作用)，藥物很難通過(guò)胃腸道壁被人體完全吸收，口服給藥面臨巨大挑戰(zhàn)。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者們探索利用功能化納米藥物遞送系統(tǒng)來(lái)提高口服給藥后的藥物生物利用度。

2、現(xiàn)有技術(shù)從腫瘤細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞和干細(xì)胞中分離的細(xì)胞外囊泡已被用于靶向藥物遞送。然而，細(xì)胞系產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡的產(chǎn)量較低，因此很難達(dá)到商業(yè)藥物生產(chǎn)所需的水平，同時(shí)，細(xì)胞系產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡的蛋白成分在全身給藥時(shí)可能會(huì)引起免疫反應(yīng)。細(xì)胞外囊泡或胞外囊泡(extracellular?vesicles，evs)是由細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，含有多種免疫調(diào)節(jié)蛋白和micrornas，在多種生理代謝過(guò)程中扮演重要角色。胞外囊泡包含多種生物分子，如脂質(zhì)、代謝物、細(xì)胞質(zhì)、核酸和細(xì)胞表面蛋白。胞外囊泡因其在實(shí)驗(yàn)室研究和臨床治療方面的潛在應(yīng)用價(jià)值而備受關(guān)注。胞外囊泡攜帶和傳遞一些重要信號(hào)分子的能力形成了一種新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，前述能力與健康的維持和疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，胞外囊泡長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是小分子、核酸和其他生物有效載荷的藥物輸送系統(tǒng)。細(xì)胞給藥和納米技術(shù)的綜合優(yōu)勢(shì)使得胞外囊泡具有更好的靶向能力、生物安全性和更高的給藥效率。然而，有限的胞外囊泡和漫長(zhǎng)的分離過(guò)程仍然阻礙了胞外囊泡的應(yīng)用。眾所周知，胞外囊泡可以在大多數(shù)天然體液中找到，包括血液、尿液、唾液和母乳。牛乳的來(lái)源豐富、成本低、可大量制備、跨越生物屏障能力強(qiáng)，同時(shí)，乳源性細(xì)胞外囊泡具有良好的生物相容性(良好的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力)和低免疫原性，可在腸道等部位或運(yùn)輸?shù)窖h(huán)系統(tǒng)后發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，克服腸上皮細(xì)胞屏障和血管內(nèi)皮屏障而進(jìn)入血液循環(huán)，即乳源性細(xì)胞外囊泡穿越胃腸道屏障的能力在載藥和疾病治療研究中具有廣泛的前景。

3、牛乳是分離胞外囊泡的理想選擇。然而，牛奶的成分復(fù)雜，通過(guò)不同的提取方法獲得的乳源性細(xì)胞外囊泡可能會(huì)影響其口服給藥。已有研究表明，源于母乳和牛乳的細(xì)胞外囊泡(milk-derived?extracellular?vesicles，mevs)能夠耐受胃腸道消化環(huán)境(可在胃中的強(qiáng)酸性條件和腸道中的講解調(diào)節(jié)下存活)，即在胃液和多種蛋白酶存在的條件下仍能保持活性，而且進(jìn)入腸道后仍能保持完整性。另一方面，胞外囊泡作為來(lái)源于日常食品的載體，口服途徑的生物安全性和可接受度可以得到保證，arntz等研究表明，口服乳源性細(xì)胞外囊泡本身可以改善自發(fā)性和誘導(dǎo)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病(arntz?o?j,pieters?b?c,oliveira?m?c,broeren?m?g,bennink?m?b,de?vries?m,van?lent?p?l,koenders?m?i,vanden?berg?w?b,van?der?kraan?p?m?et?al.oral?administration?of?bovine?milkderived?extracellular?vesicles?attenuates?arthritis?in?two?mouse?models.molnutr?food?res.2015；59:1701-1712)，這表明其在口服給藥應(yīng)用中有巨大的潛力。在藥物載體方面，geonhee?han等觀察到mev/tnf-αsirna可通過(guò)胃腸道到達(dá)結(jié)腸炎病變處，穩(wěn)定性極好，成功逆轉(zhuǎn)結(jié)腸炎引起的炎癥細(xì)胞因子失衡(han?g,kim?h,jang?h,kim?e?s,kim?s?h,yang?y.oral?tnf-αsirna?delivery?via?milk-derived?exosomes?for?effectivetreatment?of?inflammatory?bowel?disease.bioact?mater.2024；34:138-149)。ashishk.等人提出了通過(guò)乳源性胞外囊泡裝載紫杉醇(pac)進(jìn)行口服藥物的可能性，以避免出現(xiàn)與目前可用的靜脈注射pac治療相關(guān)的嚴(yán)重毒性現(xiàn)象。yi?h等報(bào)道乳源性胞外囊泡在口服給藥途徑中對(duì)結(jié)腸炎癥有緩解和保護(hù)作用。因此，與其他來(lái)源的胞外囊泡相比，近年來(lái)研究人員越來(lái)越關(guān)注乳源性胞外囊泡在藥物遞送，特別是口服給藥方面的應(yīng)用。

4、然而，盡管牛乳來(lái)源豐富，但牛奶中含有大量的游離蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)，影響了胞外囊泡的提取和純化，從而限制了乳源性胞外囊泡的進(jìn)一步應(yīng)用。超速離心法是最經(jīng)典的胞外囊泡的分離方法，產(chǎn)率高，但操作繁瑣。bao,h.等采用將經(jīng)典的梯度離心法和超速離心法相結(jié)合的方式從間充質(zhì)干細(xì)胞和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中分離出胞外囊泡，構(gòu)成了“偽細(xì)胞”系統(tǒng)的核心(bao?h,tian?y,wang?h,ye?t,wang?s,zhao?j,qiu?y,li?j,pan?c,ma?g?etal.exosome-loaded?degradable?polymeric?microcapsules?for?the?treatment?ofvitreoretinal?diseases.nat?biomed?eng.2023)。雖然胞外囊泡的分離方法在不斷發(fā)展，但目前新興的凝膠過(guò)濾層析和免疫捕獲分離胞外囊泡的純度和產(chǎn)率一直較低，且現(xiàn)有分離方法成本較高，前述原因制約了胞外囊泡的進(jìn)一步應(yīng)用和臨床轉(zhuǎn)化。有研究認(rèn)為，多孔硅納米顆粒與腫瘤細(xì)胞共孵育后，可通過(guò)自噬促進(jìn)胞外分泌(胞吐)，從而提高胞外囊泡的產(chǎn)量，但該方法的高復(fù)雜性限制了其應(yīng)用。對(duì)于乳源性胞外囊泡的分離方法，目前大多與從其他來(lái)源提取胞外囊泡的方法相同，利用超速離心法、酸沉淀法以及免疫捕獲法等進(jìn)行提純。

5、超速離心法利用胞外囊泡與牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪和細(xì)胞碎片等物質(zhì)間沉降系數(shù)間的差異，在一定轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間等條件下得到具有不同沉降系數(shù)的物質(zhì)沉淀，從而實(shí)現(xiàn)從牛奶中分離提純得到胞外囊泡。盡管超速離心法仍然是現(xiàn)階段提取外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)，在相關(guān)研究中也依舊占據(jù)主導(dǎo)地位，但該方法的提取過(guò)程需要重復(fù)進(jìn)行多次離心操作，過(guò)程繁瑣，對(duì)儀器的要求較高，且提取的目標(biāo)物質(zhì)易發(fā)生聚集、純度較低。密度梯度離心法將超速離心力與蔗糖溶液形成的連續(xù)密度階層相結(jié)合，利用物質(zhì)的密度差異實(shí)現(xiàn)分離，盡管該方法可以提高分離純度，但操作步驟將變得更加繁復(fù)。酸性沉淀法是在超速離心法的基礎(chǔ)上，利用酸性可使牛奶中游離蛋白變性的原理，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)化提取流程的目的，然而酸的使用可能會(huì)對(duì)膜的完整性產(chǎn)生影響，從而出現(xiàn)牛奶中胞外囊泡產(chǎn)率降低等問(wèn)題。免疫捕獲法是基于膜表面存在的一些特異性蛋白，通過(guò)將這些蛋白與載體上的各種特異性抗體相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)分離提純的目的。這種依賴于免疫親和力的提取方法所得產(chǎn)物雖然純度高，但提取成本也隨之升高，難以用于胞外囊泡的批量化生產(chǎn)。

6、公布號(hào)為cn109468265a的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種提取乳外泌體的方法，所述方法包括以下步驟：(1)取乳樣，在2000g、4℃、30min離心，收集上清液a；(2)將收集到的上清液a在12000g、4℃、30min離心，收集上清液b；(3)將收集到的上清液b進(jìn)一步調(diào)節(jié)ph至5.5-6.0；(4)在36-37℃水浴條件下，將凝乳酶添加于調(diào)節(jié)ph后的上清液b中，析出乳蛋白沉淀，得到上清液c；(5)將上清液c能夠通過(guò)0.22μm膜的亞組分冷凍干燥成粉，即為乳外泌體。其中，步驟(1)中所述乳樣能夠?yàn)樾迈r的乳樣或者-80℃冷凍保存解凍后的乳樣。與傳統(tǒng)的離心-超高速離心方法相比，該方法減少了超高速離心方法的步驟，節(jié)約了提取時(shí)所用耗材成本，同時(shí)加大了樣本提取體積。

7、綜上所述，目前還未能開(kāi)發(fā)出一種快速高效、用于提高藥物輸送能力的細(xì)胞外囊泡的制備方法。胞外囊泡的提取是其后續(xù)研究與應(yīng)用的基石，因此亟需開(kāi)發(fā)一種高效便捷、藥物輸送能力強(qiáng)的提取方法，進(jìn)而為牛奶胞外囊泡的應(yīng)用與發(fā)展提供支持。

8、此外，一方面由于對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解存在差異；另一方面由于申請(qǐng)人做出本發(fā)明時(shí)研究了大量文獻(xiàn)和專利，但篇幅所限并未詳細(xì)羅列所有的細(xì)節(jié)與內(nèi)容，然而這絕非本發(fā)明不具備這些現(xiàn)有技術(shù)的特征，相反本發(fā)明已經(jīng)具備現(xiàn)有技術(shù)的所有特征，而且申請(qǐng)人保留在背景技術(shù)中增加相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)之權(quán)利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在提出一種更加溫和的方式使牛奶中蛋白質(zhì)變性，從而在簡(jiǎn)便的基礎(chǔ)上得到更加安全友好的乳源性胞外囊體。基于此，本發(fā)明利用低溫環(huán)境即低溫冷凍法使蛋白質(zhì)變性。牛奶中的水分按結(jié)合程度可分為結(jié)合水和自由水，其中，結(jié)合水和蛋白質(zhì)分子上的活性基團(tuán)牢固地結(jié)合在一起，而自由水不受任何束縛，可自由移動(dòng)。在低溫環(huán)境下，牛奶在被冷凍的過(guò)程中，自由水首先結(jié)冰，而結(jié)合水較難結(jié)冰。當(dāng)溫度低至一定程度后，部分結(jié)合水與蛋白質(zhì)脫離后被凍結(jié)形成冰晶，導(dǎo)致相鄰蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用，使其凝聚從而引起牛奶中蛋白質(zhì)的不可逆變性。在冰晶向樣品內(nèi)部推進(jìn)的過(guò)程中，蛋白質(zhì)在冰-水界面富集，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與冰表面接觸時(shí)，由于低溫削弱了水和疏水基團(tuán)之間的相互作用力，嵌入在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水部分容易暴露在蛋白質(zhì)表面，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的展開(kāi)，使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。除此之外，低溫環(huán)境中冰晶的形成導(dǎo)致牛奶中被排除的脂肪、維生素和礦物質(zhì)等物質(zhì)就會(huì)向殘存的水分移動(dòng)，使得未凍結(jié)成分成為濃縮溶液，因而使得胞外囊體與其他成分分離。

2、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)之不足，本發(fā)明第一方面提供一種用于提高藥物輸送能力的細(xì)胞外囊泡的制備方法，包括：將牛奶置于第一溫度條件下進(jìn)行冷凍處理以使得相鄰蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用而聚集，得到冷凍奶液；將冷凍奶液置于第二溫度條件下進(jìn)行解凍處理以使得奶液分層，得到解凍奶液；離心除去分層的解凍奶液中的細(xì)胞碎片、脂肪和蛋白聚集物中的一種或多種，得到中間層乳清；將中間層乳清進(jìn)行過(guò)濾和離心處理，得到細(xì)胞外囊泡，其中，所述第一溫度條件和第二溫度條件按照如下方式設(shè)置，即，使得所述細(xì)胞外囊泡傾向于通過(guò)胃腸道在肝臟中積累。

3、現(xiàn)有技術(shù)例如公布號(hào)為cn109468265a的中國(guó)專利申請(qǐng)僅公開(kāi)提取乳外泌體的方法，完全不涉及將牛奶進(jìn)行冷凍處理和解凍處理，通過(guò)設(shè)置冷凍和解凍過(guò)程的溫度和/或時(shí)間，使得過(guò)濾和離心處理后得到的細(xì)胞外囊泡在體內(nèi)表現(xiàn)出與未經(jīng)冷凍和解凍處理提取的細(xì)胞外囊泡的不同的代謝路徑。尤其未公開(kāi)通過(guò)設(shè)置冷凍和解凍過(guò)程的溫度，使得提取獲得的細(xì)胞外囊泡相比于醋酸沉淀法分離的胞外囊泡和超速離心法分離的細(xì)胞外囊泡，在口服后更有可能通過(guò)胃腸道在肝臟中積累，而非更傾向于留在腸道中。進(jìn)一步地，發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)該性質(zhì)尤其適用于將如此獲取的細(xì)胞外囊泡應(yīng)用于口服給藥載體的制備，尤其是口服胰島素和/或治療非酒精性脂肪性肝炎的給藥載體的制備，以提高藥物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率。

4、本發(fā)明比較了低溫冷凍、醋酸處理和連續(xù)超離心三種方法制備的mevs的口服特性。本發(fā)明首次提出并利用的低溫冷凍方法提取的mevs的純度更高，evs相關(guān)蛋白富集程度更高，總產(chǎn)量最高(是acid-m-evs的25倍，是ultra-m-evs的2倍)。在體外caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)acid-m-evs的細(xì)胞攝取效果最好，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率最低，而cryo-m-evs的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率最好。同樣，當(dāng)小鼠分別被飼喂cryo-m-evs、acid-m-evs和ultra-m-evs時(shí)，cryo-m-evs可穿過(guò)胃腸道屏障在肝臟內(nèi)積累，而acid-m-evs主要停留在小腸上皮內(nèi)，ultra-m-evs在腸道和肝臟均有積累。此外，在caco-2細(xì)胞或小鼠接受mevs處理時(shí)，這三種mevs均未出現(xiàn)副作用，表明mevs具有良好的安全性和生物相容性。特別地，當(dāng)本發(fā)明使用mevs作為口服藥物輸送系統(tǒng)時(shí)，可以根據(jù)需要解決的疾病來(lái)改變mevs的提取方法。不同的提取方法可能導(dǎo)致mevs的蛋白質(zhì)組成和脂質(zhì)組成的差異。

5、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，在將牛奶置于第一溫度環(huán)境下進(jìn)行冷凍處理以得到冷凍奶液的過(guò)程中，其目的是得到所含游離蛋白聚集變性的牛奶。

6、優(yōu)選地，在將中間層乳清進(jìn)行過(guò)濾得到過(guò)濾奶液的過(guò)程中，其目的是除去較大不溶性雜質(zhì)。

7、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，第一溫度條件能夠?yàn)?80℃～-20℃。優(yōu)選地，第一溫度條件能夠?yàn)?20℃。

8、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，牛奶置于第一溫度條件下進(jìn)行冷凍處理的時(shí)間為5～60d。優(yōu)選地，牛奶置于第一溫度條件下進(jìn)行冷凍處理的時(shí)間為10～60d。優(yōu)選地，牛奶置于第一溫度條件下進(jìn)行冷凍處理的時(shí)間為20～60d。更優(yōu)選地，牛奶置于第一溫度條件下進(jìn)行冷凍處理的時(shí)間為20～40d。特別優(yōu)選地，牛奶置于第一溫度條件下進(jìn)行冷凍處理的時(shí)間為40d。

9、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，第二溫度條件能夠?yàn)?5℃～37℃。優(yōu)選地，第二溫度條件能夠?yàn)?5℃～30℃。具體地，第二溫度條件能夠?yàn)?5℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。

10、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，得到中間層乳清的離心溫度能夠?yàn)?℃，相對(duì)離心力能夠?yàn)?0000g～15000g。具體地，相對(duì)離心力能夠?yàn)?0000g、10500g、11000g、11500g、12000g、12500g、13000g、13500g、14000g、14500g或15000g。優(yōu)選地，離心時(shí)間能夠?yàn)?0min。

11、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，對(duì)中間層乳清進(jìn)行過(guò)濾時(shí)所用的過(guò)濾裝置為0.22μm濾膜。

12、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，得到細(xì)胞外囊泡的離心溫度能夠?yàn)?℃，相對(duì)離心力能夠?yàn)?60000g。優(yōu)選地，離心時(shí)間能夠?yàn)?0min。

13、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，中間層乳清進(jìn)行過(guò)濾和離心處理后，使用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行重懸。具體地，磷酸鹽緩沖溶液能夠?yàn)閜bs溶液。

14、優(yōu)選地，在將過(guò)濾后的奶液進(jìn)行離心處理得到細(xì)胞外囊體沉淀的過(guò)程中，其目的是得到純度更高的牛奶細(xì)胞外囊體。

15、優(yōu)選地，用溶液對(duì)細(xì)胞外囊體沉淀進(jìn)行重懸的過(guò)程中，其目的是得到相較于超速離心過(guò)程純度更高的細(xì)胞外囊體溶液。

16、本發(fā)明第二方面提供一種細(xì)胞外囊泡，其由本發(fā)明第一方面提供的制備方法制得。本發(fā)明提供的細(xì)胞外囊泡具有提高藥物輸送能力的特性。

17、本發(fā)明第二方面提供的細(xì)胞外囊泡于制備增強(qiáng)免疫療法效果的藥物載體中的應(yīng)用，其中該細(xì)胞外囊泡能夠攜帶免疫調(diào)節(jié)劑并靶向遞送至免疫細(xì)胞。

18、本發(fā)明第三方面提供本發(fā)明第一方面提供的制備方法以及本發(fā)明第二方面提供的細(xì)胞外囊泡在制備口服給藥載體中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明第一方面提供的制備方法以及本發(fā)明第二方面提供的細(xì)胞外囊泡在制備用于口服胰島素和/或治療非酒精性脂肪性肝炎的給藥載體中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明第五方面提供一種藥物組合物，包含本發(fā)明第二方面提供的細(xì)胞外囊泡。優(yōu)選地，細(xì)胞外囊泡用于制備口服或注射給藥載體，其中該細(xì)胞外囊泡能夠保護(hù)藥物成分并控制藥物釋放。優(yōu)選地，細(xì)胞外囊泡用于制備口服給藥載體，細(xì)胞外囊泡能夠有效地包裹并輸送藥物至目標(biāo)部位。

21、本發(fā)明第六方面提供一種藥物輸送系統(tǒng)，包括本發(fā)明第二方面提供的細(xì)胞外囊泡，以及包裹在細(xì)胞外囊泡內(nèi)的藥物，用于提高藥物的靶向性和生物利用度。

22、本發(fā)明第七方面提供一種制備口服給藥載體的方法，包括將藥物與本發(fā)明第二方面提供的細(xì)胞外囊泡結(jié)合，以提高藥物的生物利用度和靶向輸送效率。

23、本發(fā)明第八方面提供一種制備藥物輸送系統(tǒng)的方法，包括以下步驟：

24、a.采用本發(fā)明第一方面提供的方法制備細(xì)胞外囊泡；

25、b.將至少一種藥物成分包裹在該細(xì)胞外囊泡內(nèi)，形成藥物輸送系統(tǒng)，用于提高藥物的輸送效率和治療效果。

26、本發(fā)明的有益技術(shù)效果至少包括：本發(fā)明提供的用于提高藥物輸送能力的細(xì)胞外囊泡的制備方法利用了低溫冷凍能夠使蛋白質(zhì)變性的原理，將低溫冷凍與經(jīng)典的超速離心法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶細(xì)胞外囊泡簡(jiǎn)便高效地提取。本發(fā)明簡(jiǎn)化了單一超速離心法提取牛奶細(xì)胞外囊泡中須經(jīng)多次高速、超速離心的過(guò)程，并且提取的牛奶細(xì)胞外囊泡相比超速離心法純度更高；另一方面，相比于傳統(tǒng)的酸性沉淀法，本發(fā)明的分離方法不僅過(guò)程簡(jiǎn)單易操作，并且在保證安全可靠的基礎(chǔ)上，提高了牛奶細(xì)胞外囊泡的純度。同時(shí)，本發(fā)明提供的分離方法經(jīng)濟(jì)便利，克服了部分現(xiàn)有方法，比如免疫捕獲法中所用提取試劑昂貴、不利于批量化生產(chǎn)的難題，具有顯著的商業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

27、受低溫環(huán)境誘導(dǎo)的牛奶中蛋白質(zhì)聚集的啟發(fā)，本發(fā)明提出了一種簡(jiǎn)單、安全、低成本的方法(即低溫冷凍處理)，用于分離乳源性細(xì)胞外囊泡。低溫冷凍利用了牛奶中的水分在低溫下冷凍和解凍使牛奶中的蛋白質(zhì)聚集沉淀的原理，該操作打破了蛋白分子間作用力，影響了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。其中，超速離心、酸沉淀、低溫冷凍等不同方法對(duì)mevs的純度、產(chǎn)量和口服生物學(xué)功能的影響尚未得到相關(guān)研究的詳細(xì)評(píng)價(jià)。本發(fā)明的研究證實(shí)了不同提取方法獲得的mevs具有不同的特點(diǎn)和應(yīng)用潛力。與醋酸處理和多種超速離心方法相比，低溫冷凍法分離的mevs產(chǎn)量分別是前述方法的25倍和2倍。低溫冷凍法分離的胞外囊泡的純度僅略低于醋酸沉淀法分離的胞外囊泡。有趣的是，低溫冷凍法分離的胞外囊泡和醋酸沉淀法分離的胞外囊泡被證明具有更高的細(xì)胞攝取效率，并且低溫冷凍法分離的胞外囊泡具有最佳的上皮轉(zhuǎn)運(yùn)效果。值得注意的是，口服三種方法提取的三種乳源性胞外囊泡后，低溫冷凍法分離的胞外囊泡更有可能通過(guò)胃腸道在肝臟中積累，而醋酸沉淀法分離的胞外囊泡和超速離心法分離的胞外囊泡更傾向于留在腸道中。

28、evs作為一種天然的細(xì)胞間信息載體，尤其是來(lái)源充足的mevs，在藥物傳遞領(lǐng)域具有很大的潛力。由于目前缺乏統(tǒng)一的提取方法選擇標(biāo)準(zhǔn)，極大地限制了其推廣。與細(xì)胞培養(yǎng)基相比，牛奶的成分更為復(fù)雜，因此從牛奶中獲得mevs的步驟更為繁瑣?；诖耍狙芯刻岢霾煌崛》椒ǐ@得的mevs導(dǎo)致其口服性質(zhì)的差異。

29、綜上所述，本發(fā)明驗(yàn)證了不同提取方法獲得的mevs口服特性的差異，研究結(jié)果可以為mevs未來(lái)作為口服給藥系統(tǒng)的應(yīng)用提供更多個(gè)性化的選擇。此外，有必要建立一個(gè)統(tǒng)一的綜合評(píng)價(jià)體系，為mevs提取方法的選擇標(biāo)準(zhǔn)提供更好的質(zhì)量控制和更廣泛的應(yīng)用。