技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物基功能納米材料的制備領(lǐng)域，具體而言是一種以綠茶提取物為基本原料，不添加外源助劑而得到一系列形貌、大小可控的抗氧化聚茶多酚納米材料。

背景技術(shù)：
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生物基材料(bio-basedmaterials)指的是利用谷物、秸稈等可再生生物質(zhì)為原料的高分子材料。當(dāng)今社會(huì)能源逐漸緊缺，生物基材料由于來源廣泛、可再生、環(huán)境友好和節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，正逐步吸引人們的注意力，有望成為引領(lǐng)當(dāng)代科技創(chuàng)新和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一大產(chǎn)業(yè)。生物基材料可大致分為兩大類，其一是可再生原料通過生物轉(zhuǎn)化直接得到的生物高分子材料；其二則是源于自然的單體經(jīng)人工聚合形成的材料。后者于前者相比，其優(yōu)勢(shì)在于能實(shí)現(xiàn)更加精細(xì)的分子和結(jié)構(gòu)上的設(shè)計(jì)。

茶是中國傳統(tǒng)飲品之一，在中國的茶文化里，飲茶有振奮精神、延年益壽的功效，當(dāng)代的科學(xué)也證明了這一點(diǎn)。茶葉中能延緩衰老的成分主要是茶多酚(teapolyphenols，簡稱tp)，茶多酚是茶葉中一系列多酚化合物的總稱，主要成分為兒茶素，包括表兒茶素(ec)、表沒食子兒茶素(egc)、表兒茶素沒食子酸酯(ecg)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)四種。相關(guān)研究表明，茶多酚以及茶多酚富集的產(chǎn)品在預(yù)防腫瘤(annualreviewofpharmacologyandtoxicology,2002；42:25-54)、心血管疾病(circulation,2004；109:2448-2453)、癌癥(molecules2007,12,946)等方面有著顯著作用。同時(shí)兒茶素具有良好的抗氧化能力和金屬離子螯合能力，故而茶多酚被視為具有開發(fā)潛力的生物基單體。與此同時(shí)，納米材料由于其微觀特性，在能源、保健和環(huán)境領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用空間。綜合以上兩點(diǎn)，以茶多酚為單體構(gòu)建功能化聚合物納米材料這一課題值得深入研究。

目前，一些合成茶多酚納米材料的方法已被報(bào)道，然而這些方法均無法避免反應(yīng)過程中外源添加劑的加入。例如，xudongli等用cu²⁺誘導(dǎo)tp的氧化偶聯(lián)，得到了中空多孔的茶多酚納米粒子，可用于藥物運(yùn)輸及響應(yīng)釋放(journaloftheamericanchemicalsociety,2013；135:4179-4182)；fei的團(tuán)隊(duì)在微波輻射下，以ag⁺作為氧化劑，tp為單體，用一鍋法合成了帶有熒光的tp-ag核殼復(fù)合納米材料(acsnano2014,8,8529)；markova等通過tp和fe³⁺合成了tp-fe納米混合物，并探究了fe³⁺在此過程中的作用(acssustainablechemistry&engineering,2014,2(7):1674-1680)。

可見，在目前被報(bào)道的工作中，研究人員普遍使用金屬離子作為添加劑；金屬離子如cu²⁺、ag⁺、fe³⁺等能有效誘導(dǎo)茶多酚氧化交聯(lián)從而得到形態(tài)規(guī)整的納米復(fù)合物，但與此同時(shí)，外源金屬離子的加入也對(duì)納米復(fù)合物的毒性和生物相容性產(chǎn)生了一定的影響；外源添加劑的加入一定程度上增加了產(chǎn)物的毒性，影響了材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，因此，更加安全無毒，符合綠色化學(xué)理念的功能化多酚納米粒子的合成方法仍待研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明提供一種不使用外源添加劑的純有機(jī)茶多酚納米粒子及其制備方法，并可以通過調(diào)整配方來調(diào)節(jié)產(chǎn)物粒子的大小，實(shí)驗(yàn)得到的粒子粒徑在100～300nm范圍內(nèi)；且本發(fā)明所得茶多酚納米粒子在自由基清除方面表現(xiàn)優(yōu)異，有望作為綠色抗氧藥物和安全無毒的食品添加劑廣泛使用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種抗氧化聚茶多酚納米材料，所述抗氧化聚茶多酚納米材料以茶多酚和茶堿為原料制備而成，各原料的質(zhì)量比為：茶多酚2重量份，茶堿0.5～2重量份。

進(jìn)一步，所述抗氧化聚茶多酚納米材料采用下述制備方法：茶多酚水溶液與茶堿水溶液在空氣氛圍中于75～85℃(優(yōu)選為80℃)攪拌反應(yīng)直至得到棕色透明的混合溶液，停止反應(yīng)；再將所得混合溶液冷卻至室溫，然后靜置至混合溶液呈渾濁狀且肉眼可見棕黃色沉淀；最后經(jīng)離心處理、洗滌得到抗氧化聚茶多酚納米材料。

進(jìn)一步，所述抗氧化聚茶多酚納米材料的粒徑在100～300nm。

進(jìn)一步，所述抗氧化聚茶多酚納米材料的粒徑通過下述方式調(diào)控：

控制茶多酚與茶堿的質(zhì)量比為1.1～1.5時(shí)，所述抗氧化聚茶多酚納米材料的粒徑為132～175nm；控制茶多酚與茶堿的質(zhì)量比為1.8～2.5時(shí)，所述抗氧化聚茶多酚納米材料的粒徑為173～240nm；控制茶多酚與茶堿的質(zhì)量比為4時(shí)，所述抗氧化聚茶多酚納米材料的粒徑為109～125nm。

本發(fā)明要解決的第二技術(shù)問題是提供一種抗氧化聚茶多酚納米材料的制備方法，所述方法為：茶多酚水溶液與茶堿水溶液在空氣氛圍中于75～85℃(優(yōu)選為80℃)攪拌反應(yīng)直至得到棕色透明的混合溶液，停止反應(yīng)；再將所得混合溶液冷卻至室溫，然后靜置至混合溶液呈渾濁狀且肉眼可見棕黃色沉淀；最后經(jīng)離心處理、洗滌得到抗氧化聚茶多酚納米材料；其中，混合溶液中茶多酚與茶堿的質(zhì)量比為：茶多酚2重量份，茶堿0.5～2重量份。

進(jìn)一步，上述方法中，所述茶多酚水溶液的質(zhì)量濃度為5～10mg/ml，所述茶堿水溶液的質(zhì)量濃度為0.5～2mg/ml。

進(jìn)一步，上述方法中，反應(yīng)前茶多酚水溶液和茶堿水溶液分別經(jīng)過超聲處理2～5分鐘，確保茶多酚和茶堿完全溶解。

進(jìn)一步，上述方法中，茶多酚水溶液與茶堿水溶液在空氣氛圍中于攪拌反應(yīng)24～36小時(shí)(優(yōu)選為30小時(shí))得到棕色透明的混合溶液。

進(jìn)一步，茶多酚水溶液與茶堿水溶液反應(yīng)前先分別在75～85℃下預(yù)熱10～15min。

進(jìn)一步，上述方法中，離心處理中，離心速率為12000～16000r/min(優(yōu)選為15000r/min)，離心時(shí)間為5～12分鐘(優(yōu)選為10分鐘)。

進(jìn)一步，上述方法中，冷卻至室溫靜置24～72(優(yōu)選為48小時(shí))小時(shí)。

進(jìn)一步，上述方法中，采用蒸餾水洗滌至少三次。

本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供上述抗氧化聚茶多酚納米材料在氧化劑中的用途。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明合成方法原料均屬于茶葉提取物，來源廣泛、可再生，合成時(shí)以去離子水為分散劑，反應(yīng)過程中亦不再添加其他試劑，保證了產(chǎn)物粒子的毒性更低，綠色環(huán)保，安全可靠，在食品安全、生物醫(yī)藥領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。

2、本發(fā)明所得的茶多酚納米粒子為純有機(jī)質(zhì)，反應(yīng)原料均來自于茶葉，無外源添加劑即可得到形狀規(guī)整、大小可控、大小均一且分布均勻的抗氧化聚茶多酚納米粒子。

3、本發(fā)明方法制備的抗氧化聚茶多酚納米粒子在自由基清除能力上遠(yuǎn)超同等粒徑的聚多巴胺納米粒子，是一種良好的抗氧化試劑。

4、本發(fā)明方法配方簡單，成本較低，工藝流程短，簡便易行，合成過程無污染，屬于符合綠色化學(xué)理念的制備方案。

附圖說明：

圖1a為tp濃度2mg/ml，不添加茶堿時(shí)，在80℃下反應(yīng)30h所得產(chǎn)物sem圖；圖1b-f為本發(fā)明實(shí)施例1-5采用不同配方所得產(chǎn)物的sem圖，其中，反應(yīng)初始tp濃度均為2mg/ml：圖1(b)茶堿濃度0.5mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚納米材料記為pn-1，粒徑117±8nm；圖1(c)茶堿濃度0.8mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚納米材料記為pn-2，粒徑191±18nm；圖1(d)茶堿濃度1.1mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚納米材料記為pn-3，粒徑213±27nm；圖1(e)茶堿濃度1.4mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚納米材料記為pn-4，粒徑152±23nm；圖1(f)茶堿濃度1.7mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚納米材料記為pn-5，粒徑149±17nm。

圖2為對(duì)比例1所得聚多巴胺納米粒子sem圖，圖2(a)：粒徑196±13nm的pda-1,；圖2(b)：粒徑146±19nm的pda-2。

圖3為對(duì)實(shí)施例1所得抗氧化聚茶多酚納米粒子進(jìn)行epr檢測所得到的譜圖。

圖4為對(duì)實(shí)施例2-5所得抗氧化聚茶多酚納米粒子和對(duì)比例1所得粒徑相近的聚多巴胺納米粒子進(jìn)行自由基清除實(shí)驗(yàn)所得曲線圖。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明中，茶多酚的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)在空氣中即可自發(fā)氧化形成醌結(jié)構(gòu)，被氧化后的茶多酚能與未被氧化的茶多酚反應(yīng)生成二聚物，該二聚物的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)再次被氧化，重復(fù)上述過程，從而實(shí)現(xiàn)茶多酚小分子的聚合；然而，具體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在僅僅使用茶多酚為唯一單體的情況下，無法得到外觀形態(tài)規(guī)整的聚合物(如圖1a)，原因在于茶多酚自發(fā)氧化反應(yīng)時(shí)交聯(lián)位點(diǎn)不夠，不足以形成三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)。因此，尋找一種合適的試劑促進(jìn)tp交聯(lián)是有必要的。本發(fā)明首次選擇茶堿作為添加劑來促進(jìn)茶多酚的氧化交聯(lián)。

本發(fā)明進(jìn)一步探索到可選取如下反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為80℃，分散相為水相，在空氣下進(jìn)行氧化；高溫下反應(yīng)30h后，將反應(yīng)原液冷卻到室溫，靜置48h后進(jìn)行離心，離心時(shí)轉(zhuǎn)速15000r/min，時(shí)間10min；用掃描電鏡(sem)觀察離心所得產(chǎn)物，為尺寸較均一，分布均勻的納米小球；對(duì)離心所得的褐色沉淀進(jìn)行冷凍干燥，最終得到黃褐色粉末。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。

本發(fā)明的實(shí)施例中，新鮮綠茶多酚(tp)粉(茶多酚wt％≥95％，即茶多酚的純度≥95％)購自無錫太陽綠色電力有限公司(中國江蘇)。茶堿購自sigma-aldrich，純度≥98％。

實(shí)施例1-5抗氧化聚茶多酚納米粒子(pn-i,i＝1-5)的制備

原料：茶多酚、茶堿，各原料用量配比關(guān)系如表1所示。

制備方法：具體制備步驟如下：

(1)原料準(zhǔn)備：按照表1稱量相應(yīng)質(zhì)量的tp粉和茶堿粉末，溶于去離子水中分別配制成tp水溶液和茶堿水溶液，并采用超聲處理的方法超聲處理2～5分鐘確保茶多酚和茶堿充分溶解；然后放入油浴鍋(80℃)中預(yù)熱；

(2)反應(yīng)過程：將預(yù)熱好的茶堿溶液與tp溶液混合，確保反應(yīng)體系存在空氣的參與，反應(yīng)溫度80℃；可以觀察到，溶液在開始時(shí)呈淺粉色，攪拌約5小時(shí)后，溶液變黃；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，顏色逐漸加深，30小時(shí)后獲得棕色透明溶液；

(3)后期處理：將反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫，并在室溫下儲(chǔ)存48小時(shí)，溶液在此過程中逐漸變得混濁；對(duì)其進(jìn)行離心(15000r/min，10分鐘)，可得到棕黃色粉末，用蒸餾水洗滌三次得到樣品粒子pn-i(i＝1-5)。

粒子表征：

將實(shí)施例1-5所得樣品粒子pn-i(i＝1-5)進(jìn)行掃描電鏡(sem)測試，觀察粒子形貌并統(tǒng)計(jì)粒徑；并對(duì)tp濃度2mg/ml，不添加茶堿時(shí)，在80℃下反應(yīng)30h所得產(chǎn)物進(jìn)行sem測試；結(jié)果如圖1和表1所示。同時(shí)用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(dls)檢測納米粒子的大小，結(jié)果也表明不同配方所得的粒子直徑也存在明顯的差異，規(guī)律與sem結(jié)果相同。另外，還測量了實(shí)施例所得各組納米粒子的zeta電位，分散相為去離子水，所得數(shù)值均在-30mv以下，證明本發(fā)明實(shí)施例所得pns(各實(shí)施例所得合成茶多酚納米材料)表面為天然負(fù)電位，能在水中穩(wěn)定分散。

表1pn-i(i＝1-5)對(duì)應(yīng)的配方和表征結(jié)果

表1中，mg/ml為原料占總反應(yīng)體系的濃度；如茶多酚mg/ml是指1ml混合溶液(茶多酚溶液和茶堿溶液形成的混合溶液)中茶多酚的濃度初始ph值為將原料混合后，反應(yīng)起始點(diǎn)的ph值。

抗氧化聚茶多酚納米粒子的抗氧化活性檢測：

電子順磁共振(epr)方法被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的抗氧化活性研究中，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物粒子epr的測定和自由基清除實(shí)驗(yàn)來檢測茶多酚納米粒子(pns)的抗氧化活性。

epr的測定方式如下：brukerepremx_plus上進(jìn)行抗氧化聚茶多酚納米粒子粉末的epr(電子順磁共振)測試；波譜儀在x-band(9.85ghz)下運(yùn)行，并且在0.1mw功率下以100khz場調(diào)制獲得光譜；抗氧化聚茶多酚納米粒子pn-1(實(shí)施例1)的epr圖如圖3所示，pns的epr譜圖與文獻(xiàn)中報(bào)道的具有自由基清除能力的聚多巴胺納米粒子epr譜圖類似。由圖3可知：所得的抗氧化聚茶多酚納米粒子成分中有自由基的存在，可進(jìn)一步探究其自由基清除能力。

自由基清除實(shí)驗(yàn)操作方式如下：結(jié)合抗氧化聚茶多酚納米粒子(pns)的水溶性，使用純度為97.0％(lc)的2,2-二苯基-1-苦肼基(dpph)測定來評(píng)估不同粒子的自由基清除活性，一般程序如下所述：現(xiàn)配的濃度為0.1mm的dpph/乙醇溶液，將100μg的抗氧化聚茶多酚納米粒子粉末加入到dpph溶液中，反應(yīng)體系中dpph的初始濃度為0.1mm，總體積為10ml，通過測量反應(yīng)體系隨著時(shí)間推進(jìn)在517nm處的吸光度變化來評(píng)估清除活性，一般地，每五分鐘取一個(gè)樣品點(diǎn)進(jìn)行測試，直到吸光度不變。

對(duì)比例1

為了證明pns在自由基清除上的優(yōu)勢(shì)，制備粒徑相仿的聚多巴胺納米粒子進(jìn)行比較。聚多巴胺納米粒子的制備：稱量一定量的多巴胺鹽酸鹽固體，置于一定體積比的乙醇水溶液中溶解，待固體完全溶解后加入少量的氨水調(diào)節(jié)ph值，反應(yīng)12小時(shí)后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心處理，得黑色沉淀物，用去離子水反復(fù)洗滌；合成方法根據(jù)文獻(xiàn)(k.-y.ju,etal.biomacromolecules,2011；12:625-632)中的方法，制備得到了不同原料比的聚多巴胺納米粒子pda-1、pda-2；對(duì)比例1所得聚多巴胺納米粒子sem圖如圖2所示；圖2表明制得的聚多巴胺納米粒子pda-1、pda-2的粒徑分別同本發(fā)明實(shí)施例所得pn-3(pn-2)、pn-5(pn-4)粒徑相近。并對(duì)所得聚多巴胺納米粒子進(jìn)行了自由基清除實(shí)驗(yàn)，自由基清除實(shí)驗(yàn)操作方法同上。本發(fā)明實(shí)施例2-5所得抗氧化聚茶多酚納米粒子和聚多巴胺納米粒子的自由基清除曲線如圖4所示。

結(jié)果表明，本發(fā)明在其他反應(yīng)條件不變的前提下，通過調(diào)整配方中茶多酚與茶堿的質(zhì)量比，一組不同粒徑的抗氧化聚茶多酚納米粒子可被制取。經(jīng)過對(duì)掃描電鏡圖(sem)的統(tǒng)計(jì)和動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(dls)的驗(yàn)證，試驗(yàn)中不同配方所得的粒子直徑存在明顯的差異。進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)所得各組納米粒子的zeta電位哦數(shù)值均在-30mv以下，證明了該方法得到的茶多酚納米粒子自然呈表面負(fù)電，無需表面修飾即可在水中穩(wěn)定分散。