本發(fā)明涉及一種專門用于培養(yǎng)厭氧菌的裝置和方法，尤其是涉及一種用苛氧菌進行厭氧培養(yǎng)的裝置及方法。

背景技術：

厭氧菌(anaerobicbacteria)是指一類需要生長在低氧或無氧條件下的微生物，因為厭氧微生物沒有完整的代謝酶系，故以無氧發(fā)酵的方式進行能量代謝，其生存需在較低的氧化還原電勢條件下才能進行。動物體內的一些低氧化還原電勢的組織為厭氧菌的生長繁殖提供了有利條件。厭氧菌的研究一直是臨床醫(yī)學的重心。厭氧菌可進入血液引起菌血癥、敗血癥等，嚴重威脅病人生命。近10年來研究證明，無芽胞厭氧桿菌及球菌是細菌性感染的重要原因之一，當深部膿腫、敗血癥等常規(guī)細菌學檢查陰性時，往往源于厭氧菌感染.厭氧菌感染是一種內源性感染，病原菌遍及臨床各科，人體的各個部位，各種器官均可發(fā)生厭氧菌感染，據文獻報道，10％的菌血癥可檢出厭氧菌，牙源性口面部感染病例中有94％，吸入腳市炎及肺膿腫時有93％，婦產科各種感染性疾病中有100％，直腸周圍膿腫有77％可檢出厭氧菌，而且有相當一部分病例是單一的厭氧菌感染。

同時，厭氧菌是研究微觀生態(tài)平衡、失調和調整的重要部分，在消化道菌群中，99％以上為厭氧菌，它們組成了重要的消化菌群，并在生物拮抗、營養(yǎng)、免疫等方面具有不可估量的意義。另外，以消化道菌群為研究對象的微生態(tài)學已取得了大量科研成果，厭氧微生物的分離、培養(yǎng)、篩選，有利于發(fā)現(xiàn)更多有益功能的微生物，豐富微生物菌種質資源，有利于人類進一步揭示厭氧微生物與宿主營養(yǎng)、免疫和健康這間的關系。目前，國內外在醫(yī)學、食品和飼料領域等眾多科研和企業(yè)對此領域產生了濃厚興趣。這些研究都說明了厭氧菌的研究對于人或經濟物種的疾病防治具有重大意義。

目前常見的厭氧分離培養(yǎng)方法常采用瓊脂稀釋振蕩法(agarshakedilutionmethod)、亨蓋特滾管技術(hungateroll-tubetechnique)、厭氧罐(anaerobicjar)或厭氧袋(bio-bag)培養(yǎng)法、厭氧手套操作箱。近幾年，有些學者將應用于好氧培養(yǎng)的高通量分選技術應用到厭氧培養(yǎng)。

瓊脂稀釋振蕩法是將菌液進行濃度梯度稀釋后注入50℃左右的無氧液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基試管中，振蕩使混勻，待培養(yǎng)基凝固之后，加入石蠟密封，培養(yǎng)一段時間后可在瓊脂柱內部或試管內壁長出肉眼可辨菌落。該方法的缺點在于由于有的菌落會生長在凝固的瓊脂中，所以不利于觀察菌落形態(tài)，也給單菌落的挑取帶來不便。

亨蓋特滾管技術是美國著名的微生物學家hungate在1950年發(fā)明，后經不斷改進，目前應用也較多。其原理是利用高溫加熱的銅柱消耗空氣中的氧氣反應來獲得高純氮氣培養(yǎng)環(huán)境，并在培養(yǎng)基配制和分裝過程中使用高純氮氣驅逐空氣。從培養(yǎng)基的配制到菌種的接種及培養(yǎng)等過程都在高度無氧條件下，從而保證嚴格厭氧菌的存活。該方法是將菌液進行濃度梯度稀釋后注入50℃左右的無氧液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基中，然后用滾管機滾管或將試管水平放置于冰塊中迅速滾動，使含有菌的培養(yǎng)基在試管內壁上凝固成一層勻質的瓊脂膜。該技術與瓊脂稀釋振蕩法相比，克服了前者難以觀察單菌落的缺點，但單菌落的挑取仍然不容易進行，操作繁瑣，技術要求較高。

厭氧袋是一種塑料材質、透明而不透氣的可密封的袋子，裝入培養(yǎng)皿后，再放入產氣袋，使袋內氧氣被消耗。也可抽真空/充氮氣反復進行2-3次以排除袋內氧氣。厭氧袋輕便易操作，是廣受推崇的厭氧培養(yǎng)容器。但該方法厭氧袋容量小，且已破損漏氣，使得環(huán)境很不恒定，培養(yǎng)批次不夠均一。

厭氧罐法是把培養(yǎng)物放進罐中，然后抽氣/充氣(氮氣或混合氣體，含氫氣)，其內部的氧氣和氫氣在催化劑的作用下反應生成水，從而清除了內部少量的氧氣。厭氧手套操作箱的出現(xiàn)，使厭氧菌的研究得到了發(fā)展，尤其是培養(yǎng)、研究嚴格厭氧菌，其解決了長久以來使用厭氧罐或厭氧袋無法進行厭氧操作的問題，使厭氧培養(yǎng)實現(xiàn)了類似好氧培養(yǎng)的過程。該儀器采用抽真空充氮氣的方法以排除實驗操作過程中帶入的大部分氧氣。隨后真空/充氮的技術漸漸顯現(xiàn)出不足之處。最大的缺點在于每次操作過程中樣品或實驗用品放入箱內時，都要反復進行抽氣/充氮，過程繁復且耗費大量氣體；真空泵磨損也會使維護成本升高。后來，有人針對這些缺陷對厭氧手套箱進行了技術升級。實現(xiàn)了無真空充氮操作，利用鈀的催化作用將厭氧操作箱內的氧氣與混合在氮氣中的氫氣催化生成水，以耗盡厭氧手套操作箱內部的氧氣。但是需要使用的氫氣給厭氧手套操作箱的使用帶來了一定的安全隱患。厭氧手套操作箱經過多年的改良和設計，除了運行成本高等問題，是目前做厭氧研究最為便利有效的儀器。

自動氧凈厭氧培養(yǎng)皿(oxyplatetm)是由美國oxyrase公司首次研發(fā)并投入生產。該培養(yǎng)皿專為厭氧培養(yǎng)設計，其內含有特定的酶系，可以消除培養(yǎng)或操作過程中帶入的氧氣，并可以持續(xù)很長時間，十分利于厭氧培養(yǎng)。但目前oxyplatetm由于制作成本高，所以價格昂貴，國內較少采用，多在臨床醫(yī)學上采用以分離厭氧致病菌，難以廣泛應用。

分離嗜熱厭氧菌的高通量法是hamilton-brehm等在2012年借助功能強大的流式細胞儀和96孔板實現(xiàn)對嗜熱厭氧菌高通量篩選及培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)環(huán)節(jié)在厭氧手套操作箱中進行。該方法的優(yōu)點是實現(xiàn)了厭氧培養(yǎng)的高通量，缺點是利用流式細胞儀進行篩選的過程是在好氧的環(huán)境中進行的，不利于分離嚴格厭氧菌；流式細胞儀及厭氧手套操作箱都是昂貴的大型儀器，且維護費用高。

海藻酸鈣微球包埋法是brner等在2013年發(fā)明的一種厭氧菌培養(yǎng)方法。其利用海藻酸鹽制備微球的過程中將單個微生物細胞包埋進微球中，然后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，微生物細胞通過微球攝取培養(yǎng)基的養(yǎng)分。整個過程需在厭氧手套操作箱中進行，也可實現(xiàn)高通量。該方法與上述分離嗜熱厭氧菌的高通量法相比，優(yōu)點在于整個包埋、培養(yǎng)過程都可在厭氧操作箱中進行，利于分離嚴格厭氧菌和生長較慢的菌。缺點也是需要流式細胞儀的分選，儀器昂貴，維護繁瑣。

以上幾種方法都存在自身難以克服的缺陷，或操作繁瑣，或設備昂貴，操作繁瑣，耗時耗材，或形成絕對無氧環(huán)境需要較長時間，或容易漏氣而使營造的無氧環(huán)境難以長久維持等。由于這些特點，有關厭氧菌的試驗研究工作，就難免受到種種技術條件的限制，不易達到目的。因此，設計一種價格低廉，方法簡便，不需催化劑的簡單實用的厭氧菌培養(yǎng)裝置就十分必要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種結構簡單，操作方法簡便，經濟實用，適宜廣泛推廣，不僅能給臨床提供直接、有效、經濟的診斷指標，而且可提高厭氧菌的陽性檢出率的新型厭氧菌培養(yǎng)裝置。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種培養(yǎng)出的厭氧菌陽性率高，結果可靠，方法簡單，適合各類微生物實驗室的厭氧菌培養(yǎng)，簡單易學，便于普及推廣的新型厭氧菌培養(yǎng)的方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：

本發(fā)明的一種厭氧菌培養(yǎng)裝置，由鋼制罐體1以及鋼制蓋體2組成，所述的鋼制罐體1與所述的鋼制蓋體2通過螺紋緊密連接；

所述的鋼制蓋體2的頂部設有提手10、出氣閥門8以及氧氣和溫度顯示器9，鋼制蓋體2的內部設有溫度傳感器探頭7以及氧氣檢測探頭11，溫度傳感器探頭7以及氧氣檢測探頭11與氧氣和溫度顯示器9相連；

所述的鋼制罐體1的內部從下到上依次設置有1個儲液器皿3、1-3個培養(yǎng)皿擱板4、1個試管擱板6以及一個試管架5；所述的儲液器皿3用于盛裝亞硫酸鈉溶液；所述的培養(yǎng)皿擱板4用于放置培養(yǎng)皿；所述的試管架5上設置有多個孔，用于放入并固定試管；所述的試管擱板6用于承托試管；所述的儲液器皿3、培養(yǎng)皿擱板4、試管擱板6以及試管架5的邊緣由一個矩形框架12連接，拿出框架的同時可將儲液器皿3、培養(yǎng)皿擱板4、試管擱板6以及試管架5一并拿出；所述的鋼制罐體1的下部設有進氣閥門13。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的鋼制蓋體2的內部頂部設有硅膠墊，所述鋼制罐體1的罐口上邊緣設有硅膠墊，以保證蓋與管體螺紋蓋緊時起到進一步密封的作用，已達到整個管體在使用時的氣密性。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的儲液器皿3的材質為玻璃或樹脂。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)皿擱板4的材質為鋼制或鋁合金。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的試管擱板6以及試管架5的材質為鋁合金、樹脂或塑料。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的矩形框架12的材質為鋼制或鋁合金。

進一步的，本發(fā)明還提出了一種使用所述的厭氧菌培養(yǎng)裝置培養(yǎng)厭氧菌的方法，包括如下步驟：

(1)制備培養(yǎng)標本，即將擬厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)菌，接種到含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中或含有液體培養(yǎng)基的試管中；

(2)迅速配制2mol/l的亞硫酸鈉溶液加入儲液器皿內，將步驟(1)制備的標本樣品放置到培養(yǎng)層，固體培養(yǎng)基標本放置在培養(yǎng)皿擱板上，液體培養(yǎng)基標本放置在試管架上；

(3)將鋼制蓋體與鋼制罐體通過螺紋擰緊密封，擰緊進氣閥門，打開出氣閥門，將真空泵軟管安裝在出氣閥門的出氣口，并啟動真空泵，將培養(yǎng)罐子內氣體抽出至罐內壓力為200mmhg；然后將氮氣管道安裝于進氣閥門，將氮氣平衡至760mmhg，打開出氣閥門，將氮氣排出，如此抽氣-充氣反復數次，殘留的氧氣由亞硫酸鈉溶液清除，觀察氧氣和溫度顯示器，當氧氣濃度小于1％時進行厭氧菌培養(yǎng)；

(4)將厭氧菌培養(yǎng)罐放置在37℃培養(yǎng)箱中進行厭氧培養(yǎng)，并定期觀察培養(yǎng)罐溫度和氧氣濃度，若發(fā)現(xiàn)氧氣濃度不達標時，應馬上進行抽氣，并充入氮氣，使培養(yǎng)罐氧氣濃度始終處于低氧或無氧的狀態(tài)。

其中，優(yōu)選的，所述的抽氣-充氣次數在5次以上，即可使容器內氣體濃度接近通入氣的濃度。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明僅使用一鋼制培養(yǎng)罐附帶適宜的培養(yǎng)裝置和廉價的耗氧試劑(亞硫酸鈉)，即可創(chuàng)造低氧或無氧的厭氧菌培養(yǎng)環(huán)境。同時，本發(fā)明設置o2和溫度檢測裝置，可以做到對罐體內培養(yǎng)環(huán)境實時監(jiān)測，可以保障厭氧菌培養(yǎng)良好培養(yǎng)環(huán)境。因此，其具備價格低廉，簡便實用，厭氧培養(yǎng)環(huán)境可控，無需催化劑的簡單實用的特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的厭氧菌培養(yǎng)裝置的結構示意圖。

圖中：1-鋼制罐體；2-鋼制蓋體；3-儲液器皿；4-培養(yǎng)皿擱板；5-試管架；6-試管擱板；7-溫度傳感器探頭；8-出氣閥門；9-氧氣和溫度顯示器；10-提手；11-氧氣檢測探頭；12-矩形框架；13-進氣閥門；14-培養(yǎng)皿；15-試管。

具體實施方式

下面主要結合附圖及具體實施例對厭氧菌培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)方法做進一步詳細說明。

如圖1所示一種厭氧菌培養(yǎng)裝置，包括：鋼制罐體1、鋼制蓋體2、儲液器皿3、培養(yǎng)皿擱板4、試管架5、試管擱板6、溫度傳感器探頭7、出氣閥門8、氧氣和溫度顯示器9、提手10、氧氣檢測探頭11、鋼制矩形框架12、進氣閥門13。

本發(fā)明的厭氧菌培養(yǎng)裝置由鋼制罐體1以及鋼制蓋體2組成，所述的鋼制罐體1與所述的鋼制蓋體2通過螺紋緊密連接，鋼制蓋體2的內部頂部設有硅膠墊，鋼制罐體1的罐口上邊緣設有硅膠墊，以達到鋼制蓋體2與鋼制罐體1通過螺紋緊密連接時起到進一步密封的作用，保證整個罐體在使用時的氣密性；鋼制蓋體2的頂部設有提手10、出氣閥門8以及氧氣和溫度顯示器9，鋼制蓋體2的內部設有溫度傳感器探頭7以及氧氣檢測探頭11，溫度傳感器探頭7以及氧氣檢測探頭11與氧氣和溫度顯示器9相連；鋼制罐體1的內部從下到上依次設置有1個玻璃或樹脂材質的儲液器皿3，厭氧菌培養(yǎng)時在儲液器皿3內現(xiàn)配濃度為2mol/l的亞硫酸鈉溶液，鋼制或鋁合金材質的2個培養(yǎng)皿擱板4，鋁合金、樹脂或塑料材質的1個試管擱板6以及一個試管架5；所述的培養(yǎng)皿擱板4用于放置培養(yǎng)皿14；所述的試管架5上設置有多個孔，用于放入并固定試管15；所述的試管擱板6用于承托試管15；所述的儲液器皿3、培養(yǎng)皿擱板4、試管擱板6以及試管架5的邊緣由一個鋼制矩形框架12連接，通過該框架使得罐體內部成為一個整體，拿出框架的同時可將儲液器皿3、培養(yǎng)皿擱板4、試管擱板6以及試管架5一并拿出，可以很方便的加入取樣劑，放置預培養(yǎng)器皿；鋼制罐體1的下部設有進氣閥門13。

使用所述的厭氧菌培養(yǎng)裝置培養(yǎng)厭氧菌的方法，包括如下步驟：

(1)制備培養(yǎng)標本，即將擬厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)菌，接種到含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中或含有液體培養(yǎng)基的試管中；

(2)迅速配制2mol/l的亞硫酸鈉溶液加入儲液器皿內，將步驟(1)制備的標本樣品放置到培養(yǎng)層，固體培養(yǎng)基標本放置在培養(yǎng)皿擱板上，液體培養(yǎng)基標本放置在試管架上；

(3)將鋼制蓋體與鋼制罐體通過螺紋擰緊密封，擰緊進氣閥門，打開出氣閥門，將真空泵軟管安裝在出氣閥門的出氣口，并啟動真空泵，將培養(yǎng)罐子內氣體抽出至罐內壓力為200mmhg；然后將氮氣管道安裝于進氣閥門，將氮氣平衡至760mmhg，打開出氣閥門，將氮氣排出，如此抽氣-充氣反復數次，殘留的氧氣由亞硫酸鈉溶液清除，觀察氧氣和溫度顯示器，當氧氣濃度小于1％時進行厭氧菌培養(yǎng)；

(4)將厭氧菌培養(yǎng)罐放置在37℃培養(yǎng)箱中進行厭氧培養(yǎng)，并定期觀察培養(yǎng)罐溫度和氧氣濃度，若發(fā)現(xiàn)氧氣濃度不達標時，應馬上進行抽氣，并充入氮氣，使培養(yǎng)罐氧氣濃度始終處于低氧或無氧的狀態(tài)。

其中，所述的抽氣-充氣次數在5次以上，即可使容器內氣體濃度接近通入氣的濃度。

實施例1、產氣莢膜梭菌分離培養(yǎng)

1.1病料采集

采集表現(xiàn)典型下瀉癥狀雞的直腸內容物；對病情嚴重或瀕死雞則撲殺后剖檢，取小腸黏膜和內容物。

樣品采集后標記并迅速裝入冰盒，如果不能當天帶回實驗室處理則放入冰箱保存，運輸過程要保證冰盒里溫度夠低，適宜放入些冰袋。

1.2細菌分離與純化

1.2.1增菌培養(yǎng)

取0.1～0.2g樣品放入已滅菌的含有ft液體培養(yǎng)基的試管內。迅速配制2mol/l的亞硫酸鈉溶液加入儲液器皿3內，將上接種病料的含有ft液體培養(yǎng)基的試管插入試管架5的孔洞中，底部與下方的試管擱板6接觸。將鋼制蓋體2蓋到鋼制罐體1上并擰緊，擰緊進氣閥門13，打開出氣閥門8，將真空泵軟管安裝在出氣閥門13的出氣口，并啟動真空泵，將罐體內氣體抽出至罐內壓力為200mmhg。然后將氮氣管道安裝于進氣閥門13，將氮氣平衡至760mmhg，打開出氣閥門8，將氮氣排出，如此抽氣-充氣反復數次(在實際應用中，若抽氣-充氣次數≥5，即可使容器內氣體濃度接近通入氣的濃度)，殘留的氧氣由亞硫酸鈉溶液清除。觀察o2和溫度顯示器9，使o2濃度小于1％即可進行厭氧菌培養(yǎng)。將經過上述步驟處理的樣品及厭氧菌培養(yǎng)罐放置在37℃培養(yǎng)箱中進行厭氧培養(yǎng)并定期觀察o2和溫度顯示器9。若發(fā)現(xiàn)o2濃度不達標時，應馬上進行抽氣，并充入氮氣。使培養(yǎng)罐內o2濃度始終處于低氧或無氧的狀態(tài)。

1.2.2純化培養(yǎng)

將上接種病料的ft液體培養(yǎng)基的試管，37℃培養(yǎng)18h。增菌培養(yǎng)后，每個樣品分別稀釋至10^-2、10^-3和10^-4，取每個稀釋梯度200μl于tsc(含卵黃)平板上，用三角玻璃棒涂布均勻，將平板放入厭氧培養(yǎng)罐中的平面培養(yǎng)層上后，重復1.2.1抽負壓、充氣的步驟，以達到厭氧菌培養(yǎng)所需要求。37℃培養(yǎng)18h后，挑取周圍有乳白色渾濁暈環(huán)的疑似菌落，因產氣莢膜梭菌分解卵黃中的卵磷脂導致在含有卵黃的瓊脂平板上菌落周圍會出現(xiàn)乳白色渾濁圈。在tsc(不含卵黃)平板上用三線法劃板，在厭氧培養(yǎng)裝置培養(yǎng)18h，再挑取菌落中心為黑色的菌落，反復純化培養(yǎng)2-3次。將中心為黑色的單菌落接種于裝有ft液體培養(yǎng)基的試管中，重復1.2.1步驟，即可得到產氣莢膜梭菌純培養(yǎng)物。

以上說明對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領域技術人員理解，在不脫離權利要求限定的精神和范圍的情況下，可作出許多修改、變化或等效，但都將落入發(fā)明的保護范圍之內。