本發(fā)明涉及一種檢測(cè)硫化氫高選擇性反應(yīng)型熒光探針的應(yīng)用，其屬于精細(xì)化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硫化氫（h2s）是一種具有臭雞蛋氣味的無(wú)色氣體，對(duì)呼吸道、神經(jīng)系統(tǒng)及眼部都有刺激作用，過(guò)量吸入會(huì)致使人產(chǎn)生呼吸衰竭、意識(shí)模糊等癥狀，嚴(yán)重者甚至可能導(dǎo)致死亡。同時(shí)，h2s也是人們發(fā)現(xiàn)的“第三種”生物內(nèi)源性氣體信使分子（其他兩種分別為co和no），在生理及病理過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用，對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)意義重大。

目前，常見(jiàn)的h2s檢測(cè)方法有：比色法，電化學(xué)法，氣相色譜法以及極譜法等。然而上述方法都存在著一些不足，比如檢測(cè)標(biāo)樣的預(yù)處理過(guò)程較為復(fù)雜且通常會(huì)對(duì)樣品造成破壞，使得這些方法無(wú)法用于h2s在生物體內(nèi)的檢測(cè)，這就極大的限制了上述這些檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用。而利用熒光分子探針對(duì)體外及生物體內(nèi)的h2s進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，具有高選擇性、高靈敏度、操作便捷性及樣品非破壞性等優(yōu)點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)性能優(yōu)良的熒光探針是十分有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠兼具體外環(huán)境和活體細(xì)胞內(nèi)的硫化氫檢測(cè)的高選擇性反應(yīng)型熒光探針及其應(yīng)用，該化合物及硫解扣環(huán)產(chǎn)物的熒光屬性具有明顯差異。利用該探針?lè)磻?yīng)可對(duì)體外環(huán)境和活體細(xì)胞中硫化氫進(jìn)行定量檢測(cè)。探針2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亞甲基}丙二腈的應(yīng)用，其與硫化氫發(fā)生親核硫解反應(yīng)并扣環(huán)后可生成具有熒光發(fā)射性質(zhì)的產(chǎn)物，以達(dá)到在能在溫和條件下、高選擇性的、易檢測(cè)產(chǎn)物的目的。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)硫化氫高選擇性反應(yīng)型熒光探針的應(yīng)用，該該熒光探針為2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亞甲基}丙二腈，其結(jié)構(gòu)式如式（1）所示：

式（1）

該熒光探針的2,4-二硝基苯醚基團(tuán)與硫化氫發(fā)生親核硫解反應(yīng)并扣環(huán)，反應(yīng)產(chǎn)物為一種香豆素衍生物并能產(chǎn)生熒光，通過(guò)定量檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的熒光來(lái)測(cè)定不同樣品中硫化氫的含量。

測(cè)定硫化氫含量的步驟包括：

（1）將探針加入體積比為乙腈：pbs=9:1的混合溶劑中，所述探針的濃度為5~50μmol/l；

（2）將待測(cè)樣品加入上述探針溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)后待測(cè)樣品；反應(yīng)體系的ph為5.5-10.5，反應(yīng)體系的溫度為20-60^oc；

（3）激發(fā)波長(zhǎng)550~600nm，在600~650nm進(jìn)行熒光發(fā)射譜的檢測(cè)，得到反應(yīng)后待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度；

（4）將待測(cè)物質(zhì)熒光強(qiáng)度代入線性曲線方程，得到待測(cè)樣品中硫化氫的濃度；所述線性曲線方程為y=4.807*x-11.37，相關(guān)系數(shù)r²=0.993，其中y為625nm處反應(yīng)后待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，x為硫化氫濃度。

所述探針應(yīng)用于體外環(huán)境中的硫化氫含量或在活體細(xì)胞中進(jìn)行硫化氫含量檢測(cè)。

所述親核硫解反應(yīng)體系ph介于5.5~10.5之間；探針的濃度介于5~50μmol/l之間；體系反應(yīng)溫度介于20~60^oc之間。

該探針不具備熒光而其反應(yīng)產(chǎn)物具有熒光屬性，可采用熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物及底物的快速靈敏檢測(cè)。

一種可在體外環(huán)境和活體細(xì)胞中檢測(cè)硫化氫的高選擇性反應(yīng)型熒光探針及其應(yīng)用，該探針上的2,4-二硝基苯醚（dnp）基團(tuán)可在體外環(huán)境及hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）中與硫化氫發(fā)生親核硫解反應(yīng)，水解扣環(huán)形成一種香豆素衍生物，該產(chǎn)物具有熒光；該探針是以2,7-二羥基萘為原料，經(jīng)四步反應(yīng)合成得到。

式（1）

本發(fā)明還提供了該探針的應(yīng)用，該探針可以與硫化氫發(fā)生親核反應(yīng)，水解扣環(huán)后，通過(guò)定量檢測(cè)π-延伸香豆素衍生物的生成量來(lái)檢測(cè)乙腈-pbs體系中及細(xì)胞中的硫化氫含量，具體測(cè)定方法為：

選擇乙腈：pbs（9:1，v:v，25mm）作為體外測(cè)試體系，反應(yīng)溫度為25^oc至40^oc之間，優(yōu)選反應(yīng)溫度為37^oc，反應(yīng)ph為7.4；細(xì)胞內(nèi)孵育溫度為為37^oc，孵育ph為7.4。

反應(yīng)時(shí)間為2-60min，當(dāng)硫解環(huán)化反應(yīng)完全，熒光強(qiáng)度不再變化，進(jìn)行測(cè)定。

本發(fā)明提供的硫化氫特異性熒光探針底物的應(yīng)用，探針?lè)磻?yīng)產(chǎn)物均具有熒光屬性，可采用熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物及底物的快速靈敏檢測(cè)；熒光檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)550~600nm，在600~650nm進(jìn)行熒光發(fā)射譜的檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）該探針不具備熒光而其與硫化氫的反應(yīng)產(chǎn)物具有熒光屬性，可采用熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物及底物的快速靈敏檢測(cè)。

（2）該探針及相應(yīng)檢測(cè)過(guò)程不會(huì)受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于活體細(xì)胞中硫化氫的定量測(cè)定。

（3）高特異性：2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亞甲基}丙二腈可以特異性地與硫化氫反應(yīng)生成π-延伸香豆素衍生物。與常見(jiàn)陽(yáng)離子、陰離子及氨基酸等都不反應(yīng)，不受檢測(cè)環(huán)境的限制。（陽(yáng)離子：na⁺、k⁺、ag⁺、zn²⁺、pb²⁺、sn²⁺、ni²⁺、fe³⁺、fe²⁺、cu²⁺、mg²⁺、hg²⁺、pd²⁺、cd²⁺、cr³⁺等。氨基酸：d-phe、gsh、l-arg、l-cys等。小分子有機(jī)物：hcho、h2o2等。陰離子：hso3^－、so3^2－、no3^－、no2^－、f^－、hs^－等。）

（4）廉價(jià)易得：2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亞甲基}丙二腈及其反應(yīng)之后產(chǎn)物均可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行。

（5）高靈敏度：2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亞甲基}丙二腈具有良好的熒光發(fā)射光譜特性（600~650nm），該探針及其反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的熒光發(fā)射光譜特征，該探針的檢測(cè)下限為7.09μm。能較好的進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)，同時(shí)可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定。

附圖說(shuō)明

圖1是探針的選擇性檢測(cè)結(jié)果。

激發(fā)波長(zhǎng)為570nm時(shí)，20μm的探針加入不同化合物后在37℃下反應(yīng)60min后625nm處的熒光強(qiáng)度。(乙腈：pbs=9:1,v:v,ph=7.4;1.blank,2.na⁺,3.k⁺,4.ag⁺,5.zn²⁺,6.pb²⁺,7.sn²⁺,8.ni²⁺,9.fe³⁺,10.fe²⁺,11.cu²⁺,12.mg²⁺,13.hg²⁺,14.pd²⁺,15.cd²⁺,16.cr³⁺,17.d-phe,18.gsh,19.l-arg,20.l-cys,21.hcho,22.h2o2,23.hso3^－,24.so3^2－,25.no3^－,26.no2^－,27.f^－,28.hs^－)。

圖2濃度曲線測(cè)定

在625nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度隨硫化氫濃度(20-1400μmol/l)變化的線性關(guān)系

圖3是探針在hela細(xì)胞中的熒光成像圖。

(a)hela細(xì)胞與20μm探針共孵育30min后的明場(chǎng)成像圖；（c）是（a）的熒光成像圖；（b）是（a）與（c）的兩場(chǎng)疊加圖；

(d)hela細(xì)胞與20μm探針共孵育30min后再加入10eqnahs孵育60min后的明場(chǎng)成像圖；(f)是(d)的熒光成像圖；(e)是(d)和(f)的兩場(chǎng)疊加圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，并不因此而限制本發(fā)明。

實(shí)施例12-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亞甲基}丙二腈的合成

取50ml茄型瓶，在其中加入化合物（3）（50mg，0.13mmol），哌啶（0.5ml），冰乙酸（0.5ml），加入12ml甲苯，室溫下攪拌溶解，再向其中加入丙二腈（80mg，1.2mmol），氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫下攪拌1h，反應(yīng)結(jié)束。將25ml冰水加入到茄型瓶中，用分液漏斗洗滌分層，保留有機(jī)相，再用50ml50℃的水洗滌三次，除去過(guò)量丙二腈，保留有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)濾，減壓蒸餾除去甲苯，得到深紅色黏稠固體，用1ml石油醚打漿，過(guò)濾，用5ml50℃熱水淋洗濾餅，干燥，得到紅色固體粉末，收率90%。¹hnmr（400mhz,cdcl3）δ(ppm)：8.91~8.90(d,1h),8.37(s,1h),8.36~8.33(m,2h),7.93~7.88(m,2h),7.54~7.53(d,1h),7.40~7.38(d,1h),7.17~7.16(m,1h),7.14~7.13(m,1h),3.03(s,6h).

實(shí)施例2探針對(duì)硫化氫的選擇性

反應(yīng)在乙腈：pbs（9:1，v:v，25mm）體系中進(jìn)行，在終體積為3ml的體系中，加入一定量的探針?lè)肿?，然后加入之前配制好的不同?yáng)離子、陰離子、氨基酸及其它小分子的溶液。反應(yīng)60min后，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。（見(jiàn)圖1）

實(shí)施例3探針對(duì)硫化氫線性反應(yīng)的濃度曲線測(cè)定

反應(yīng)在乙腈：pbs（9:1，v:v，25mm）體系中進(jìn)行，在終體積為3ml的體系中分別加入不同濃度硫化氫，加入探針（終濃度20mm）反應(yīng)60min，測(cè)定熒光強(qiáng)度。（見(jiàn)圖2）。線性曲線方程為y=4.807*x-11.37（r²=0.993），其中y代表625nm處熒光強(qiáng)度，x硫化氫濃度。

實(shí)施例4探針在人宮頸癌細(xì)胞中對(duì)硫化氫濃度的測(cè)定

選取人宮頸癌細(xì)胞（hela細(xì)胞）作為研究對(duì)象，將細(xì)胞種植于六孔板中，采用含有10%小牛血清的極限必須培養(yǎng)基（minimumessentialmedium,mem）在37^oc、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基至細(xì)胞達(dá)到80%融合率，棄掉原有培養(yǎng)基，用pbs洗滌三次，然后在每個(gè)孔中加入2ml不含有胎牛血清的培養(yǎng)基，分別于0、12、24、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分取出0.2ml培養(yǎng)基，用于檢測(cè)其中硫化氫含量（見(jiàn)圖3）。