技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種魚類新品種的選育方法,尤其涉及一種新品種半滑舌鰨的分子選育方法。
背景技術(shù):
:
半滑舌鰨是我國海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)魚類之一,具有個體大、生長快、肉味鮮美等特點(diǎn),經(jīng)濟(jì)價值很高。目前常用的育種方法以種內(nèi)雜交和群體選育為主,由于在育種前不了解選育親本的遺傳信息,同時種內(nèi)雜交隨機(jī)性大,選育優(yōu)良品種的概率低,群體選育容易使親本近親交配,會出現(xiàn)種質(zhì)退化現(xiàn)象,以致出現(xiàn)了孵化率、出苗率降低、生長速度減慢、抗逆性差等性狀退化現(xiàn)象,使半滑舌鰨經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能下降。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
:
本發(fā)明的目的是為解決目前半滑舌鰨養(yǎng)殖和培育過程中,種內(nèi)雜交方法隨機(jī)性大,選育優(yōu)良品種的概率低,群體選育方法存在易產(chǎn)生近親交配,出現(xiàn)種質(zhì)退化,導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能下降的問題,針對上述問題提供的一種新品種半滑舌鰨的選育方法。
本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達(dá)到:新品種半滑舌鰨的分子選育方法,其特征在于新品種半滑舌鰨按以下步驟選育:
一、根據(jù)新品種的設(shè)計需求,挑選表型性狀符合要求的半滑舌鰨作為親本,表型性狀挑選公式為
二、檢測分析親本間的遺傳組成,a.提取親本基因組dna;b.用20對微衛(wèi)星標(biāo)記引物對親本基因組dna分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增;c.將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,獲得產(chǎn)物條帶圖片;d.利用凝膠圖像分析軟件,將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶圖片轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息數(shù)據(jù);e.將數(shù)字信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入遺傳分析軟件,計算獲得親本間的遺傳組成;
三、根據(jù)遺傳組成,選擇親本間的遺傳距離0.7~1.0作為“閾值”范圍進(jìn)行配組,親本分成2個或2個以上繁殖群體;
四、繁殖群體內(nèi)親本自由組合交配,生產(chǎn)、培育子代半滑舌鰨至性成熟;
五、以子代半滑舌鰨為新一代親本,重復(fù)操作步驟一至四,直到達(dá)到新品種半滑舌鰨性狀的設(shè)計要求,即得到新品種半滑舌鰨。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟a中提取親本基因組dna采用常規(guī)酚-氯仿抽提的方法或者使用基因組dna純化試劑盒。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟b中每對微衛(wèi)星標(biāo)記引物的pcr擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15l,包括10.8l反應(yīng)緩沖液、100ng親本個體基因組dna、0.6μl微衛(wèi)星標(biāo)記上下游引物、0.5utaqdna聚合酶和余量的滅菌超純水;其中反應(yīng)緩沖液含有終濃度10mmol/ltris-cl(ph8.3)、50mmol/lkcl、1.5mmol/lmgcl2、200μmol/ldntp和余量的超純水。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟b中pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3分鐘;94℃變性30秒,58℃復(fù)性30秒,72℃延伸30秒,循環(huán)25次;最后72℃延伸5分鐘。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟c中pcr擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測過程為:pcr擴(kuò)增產(chǎn)物先使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳2-3小時,之后將凝膠染色10分鐘,然后顯色5-10分鐘,將凝膠掃描或照相獲得產(chǎn)物條帶圖片。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的染色用染色液為0.1%硝酸銀溶液,所述的顯色用顯色液每升含有20g的naoh、0.4g的na2co3和4ml的甲醛溶液。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟b中選用的20對微衛(wèi)星標(biāo)記引物的序列為:
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(1)上游引物:gggagtcaacaaccaaacca
下游引物:cactcgcaaagactgaggtg
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(2)上游引物:actgcgtccaaactgaggag
下游引物:cattccccactcactgtcct
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(3)上游引物:tcctgtgggaggagaggaga
下游引物:acacacctgcacacaccagt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(4)上游引物:ccatccgagaccttcagtgt
下游引物:acctgctcctcctctgtgag
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(5)上游引物:acaaagctgcgttcctatcg
下游引物:ggatcctgcctttggtttct
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(6)上游引物:atcgaggaggatctgtgtgg
下游引物:gcgtgagatgcaagaaaaca
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(7)上游引物:tgcagcgcacattacctaac
下游引物:ggcacgctgaagctttaca
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(8)上游引物:cgttgccatcacacaatttc
下游引物:caacgtgcatcgtgtctctt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(9)上游引物:tgtgaagtcatgtggttctg
下游引物:tgagttggttgtatgtcctg
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(10)上游引物:ggctgcctacaaacctcaac
下游引物:gaggactcagatgcacacga
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(11)上游引物:gtttccttcctttcattcct
下游引物:gaaatggacgtctgtgattt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(12)上游引物:cacaaaattgctgcttgcat
下游引物:aacactccaaccccaggtaa
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(13)上游引物:ctgccgtgatcttcacaaaa
下游引物:tccactgggacaagaaaaca
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(14)上游引物:ctgtgaccctcctcctgct
下游引物:ctccatgctgccagtgttt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(15)上游引物:aaagaggcgtgtcatcggtt
下游引物:cccaatcgctcaagaaatcc
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(16)上游引物:taccacgctgccttcaaatg
下游引物:ttcaccactgttctgctccac
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(17)上游引物:gacgaaggtttttgaatggtta
下游引物:gtgaggcacaggcttttgga
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(18)上游引物:tccgacccacagttgtatca
下游引物:taaacagatctgctgcagtgagt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(19)上游引物:tcatcagcccagttcaaagt
下游引物:ctacctctgcttcagctgtg
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(20)上游引物:tctttaccgagaatctccctcc
下游引物:aaagggcctaccgaaagaat。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟d中使用的凝膠圖像分析軟件為gel-proanalyzer(version4.0)。
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,所述的第二步驟的步驟e中使用的遺傳分析軟件為“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”。
本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果:本發(fā)明解決了目前半滑舌鰨養(yǎng)殖和培育過程中,種內(nèi)雜交方法隨機(jī)性大,選育優(yōu)良品種的概率低,群體選育方法存在易產(chǎn)生近親交配,出現(xiàn)種質(zhì)退化,導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能下降的問題,本發(fā)明方法在選育新品種半滑舌鰨的過程中,始終檢測各代親本的繁殖譜系,以各代親本遺傳距離0.7~1.0作為“閾值”范圍進(jìn)行配組,從而既能避免近親交配,又能按照所設(shè)定的方向選擇半滑舌鰨新品種的性狀,顯著提高其經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能,增加優(yōu)良新品種的出現(xiàn)概率。
具體實(shí)施方式:下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)說明:
具體實(shí)施方式一:本實(shí)施方式新品種半滑舌鰨按以下步驟選育:一、根據(jù)新品種的設(shè)計需求,挑選表型性狀符合要求的半滑舌鰨作為親本;二、檢測分析親本間的遺傳組成;三、根據(jù)遺傳組成,選擇親本間遺傳距離0.7~1.0作為“閾值”范圍進(jìn)行配組,親本分成2個或2個以上繁殖群體;四、繁殖群體內(nèi)親本自由組合交配,生產(chǎn)、培育子代半滑舌鰨至性成熟;五、以子代半滑舌鰨為新一代親本,重復(fù)操作步驟一至四,直到達(dá)到新品種半滑舌鰨性狀的設(shè)計要求,即得到新品種半滑舌鰨。
本實(shí)施方式可根據(jù)具體需要進(jìn)行設(shè)計,如選擇培育生長速度快、體重、體厚、不可量化的表型性狀進(jìn)行挑選。
具體實(shí)施方式二:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是:步驟一中表型性狀挑選公式為
具體實(shí)施方式三:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是:步驟二中檢測分析親本間的遺傳組成:a.提取親本基因組dna;b.用20對微衛(wèi)星標(biāo)記引物對親本基因組dna分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增;c.將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,獲得產(chǎn)物條帶圖片;d.利用凝膠圖像分析軟件,將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶圖片轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息數(shù)據(jù);e.將數(shù)字信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入遺傳分析軟件,計算獲得親本間遺傳信息。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中要對被檢測分析遺傳組成的親本個體進(jìn)行標(biāo)記,可采用外部標(biāo)記如掛牌標(biāo)記、內(nèi)部標(biāo)記如pit射頻標(biāo)記或分池飼養(yǎng)等方法。
具體實(shí)施方式四:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟a中提取親本基因組dna可以采用常規(guī)酚-氯仿抽提的方法或者使用基因組dna純化試劑盒。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式五:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟b中每對微衛(wèi)星標(biāo)記引物的pcr擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15l,包括10.8l反應(yīng)緩沖液、100ng親本個體基因組dna、0.6μl微衛(wèi)星標(biāo)記上下游引物、0.5utaqdna聚合酶和余量的滅菌超純水;其中反應(yīng)緩沖液由終濃度10mmol/ltris-cl(ph8.3)、50mmol/lkcl、1.5mmol/lmgcl2、200μmol/ldntp和余量的超純水組成。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式六:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟b中pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3分鐘;94℃變性30秒,58℃復(fù)性30秒,72℃延伸30秒,循環(huán)25次;最后72℃延伸5分鐘。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式七:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟c中pcr擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測過程包括,產(chǎn)物先使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳2-3小時,之后將凝膠染色10分鐘,然后顯色5-10分鐘,將凝膠掃描或照相獲得產(chǎn)物條帶圖片。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式八:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式七的不同點(diǎn)是:步驟c中染色用染色液為0.1%硝酸銀溶液,所述的顯色用顯色液每升含有20g的naoh、0.4g的na2co3和4ml的甲醛溶液。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式七相同。
具體實(shí)施方式九:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟b中選用的20對微衛(wèi)星標(biāo)記引物的序列如下,其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同:
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(1)上游引物:gggagtcaacaaccaaacca
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微衛(wèi)星標(biāo)記引物(2)上游引物:actgcgtccaaactgaggag
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微衛(wèi)星標(biāo)記引物(16)上游引物:taccacgctgccttcaaatg
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微衛(wèi)星標(biāo)記引物(17)上游引物:gacgaaggtttttgaatggtta
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微衛(wèi)星標(biāo)記引物(18)上游引物:tccgacccacagttgtatca
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微衛(wèi)星標(biāo)記引物(19)上游引物:tcatcagcccagttcaaagt
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微衛(wèi)星標(biāo)記引物(20)上游引物:tctttaccgagaatctccctcc
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具體實(shí)施方式十:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟d中使用的凝膠圖像分析軟件為gel-proanalyzer(version4.0)。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式十一:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)是:步驟e中使用的遺傳分析軟件為“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”。其他步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式十二:本實(shí)施方式半滑舌鰨新品種按以下步驟選育:
步驟一,根據(jù)生長速度快、體重大的新品種設(shè)計要求,對海陽市黃海水產(chǎn)有限公司的3000尾半滑舌鰨親魚進(jìn)行表型性狀挑選,挑選公式為
步驟二,檢測分析親本間的遺傳組成:
a.提取親本基因組dna
對被檢測分析遺傳信息的親本個體進(jìn)行標(biāo)記,并對應(yīng)個體編號剪取0.5cm×0.5cm大小的尾鰭(約0.05g),置于4℃保溫盒內(nèi)備用,用于提取基因組dna;使用基因組dna純化試劑盒(takara,codeno.9765)提取親本基因組dna。
b.用20對微衛(wèi)星標(biāo)記引物對親本基因組dna分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增
每對微衛(wèi)星標(biāo)記引物的pcr擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15l,包括10.8l反應(yīng)緩沖液、100ng親本個體基因組dna、0.6μl微衛(wèi)星標(biāo)記上下游引物、0.5utaqdna聚合酶和余量的滅菌超純水;其中反應(yīng)緩沖液由終濃度10mmol/ltris-cl(ph8.3)、50mmol/lkcl、1.5mmol/lmgcl2、200μmol/ldntp和余量的超純水組成。pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3分鐘;94℃變性30秒,58℃復(fù)性30秒,72℃延伸30秒,循環(huán)25次;最后72℃延伸5分鐘。選用的20對微衛(wèi)星標(biāo)記引物的序列如下:
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(1)上游引物:gggagtcaacaaccaaacca
下游引物:cactcgcaaagactgaggtg
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(2)上游引物:actgcgtccaaactgaggag
下游引物:cattccccactcactgtcct
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(3)上游引物:tcctgtgggaggagaggaga
下游引物:acacacctgcacacaccagt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(4)上游引物:ccatccgagaccttcagtgt
下游引物:acctgctcctcctctgtgag
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(5)上游引物:acaaagctgcgttcctatcg
下游引物:ggatcctgcctttggtttct
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(6)上游引物:atcgaggaggatctgtgtgg
下游引物:gcgtgagatgcaagaaaaca
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(7)上游引物:tgcagcgcacattacctaac
下游引物:ggcacgctgaagctttaca
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(8)上游引物:cgttgccatcacacaatttc
下游引物:caacgtgcatcgtgtctctt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(9)上游引物:tgtgaagtcatgtggttctg
下游引物:tgagttggttgtatgtcctg
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(10)上游引物:ggctgcctacaaacctcaac
下游引物:gaggactcagatgcacacga
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(11)上游引物:gtttccttcctttcattcct
下游引物:gaaatggacgtctgtgattt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(12)上游引物:cacaaaattgctgcttgcat
下游引物:aacactccaaccccaggtaa
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(13)上游引物:ctgccgtgatcttcacaaaa
下游引物:tccactgggacaagaaaaca
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(14)上游引物:ctgtgaccctcctcctgct
下游引物:ctccatgctgccagtgttt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(15)上游引物:aaagaggcgtgtcatcggtt
下游引物:cccaatcgctcaagaaatcc
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(16)上游引物:taccacgctgccttcaaatg
下游引物:ttcaccactgttctgctccac
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(17)上游引物:gacgaaggtttttgaatggtta
下游引物:gtgaggcacaggcttttgga
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(18)上游引物:tccgacccacagttgtatca
下游引物:taaacagatctgctgcagtgagt
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(19)上游引物:tcatcagcccagttcaaagt
下游引物:ctacctctgcttcagctgtg
微衛(wèi)星標(biāo)記引物(20)上游引物:tctttaccgagaatctccctcc
下游引物:aaagggcctaccgaaagaat
c.將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,獲得產(chǎn)物條帶圖片
pcr擴(kuò)增產(chǎn)物先使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳2-3小時,之后將凝膠染色(染色液為0.1%硝酸銀溶液)10分鐘,然后顯色(顯色液每升含有20g的naoh、0.4g的na2co3和4ml的甲醛溶液)5-10分鐘,將凝膠掃描或照相獲得產(chǎn)物條帶圖片。
d.利用凝膠圖像分析軟件,將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶圖片轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息數(shù)據(jù)
使用凝膠圖像分析軟件gel-proanalyzer(version4.0)將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶圖片轉(zhuǎn)化成表格形式的數(shù)字信息數(shù)據(jù)。
e.將數(shù)字信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入遺傳分析軟件,計算獲得親本間遺傳組成
使用遺傳分析軟件“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”進(jìn)行遺傳參數(shù)的分析和計算,獲得親本間的遺傳組成。雌性群體的有效等位基因數(shù)(ne)為1.792~5.686,平均為3.578;雄性群體ne為1.471~6.116,平均為3.508。雌性群體的觀測雜合度(ho)為0.418~0.835,平均為0.606;雄性群體為0.28~0.798,平均為0.548。雌性群體的期望雜合度(he)為0.444~0.822,平均為0.696;雄性群體為0.321~0.839,平均為0.655。雌、雄親本個體間的遺傳距離,在0.254~1.959之間,平均值為0.890。
步驟三,根據(jù)親本間的遺傳組成,選擇親本間的遺傳距離0.7~1.0作為“閾值”范圍進(jìn)行配組,將雌雄親本分成2個或2個以上繁殖群體,即繁殖群體內(nèi)任意一對雌雄親本的個體間的遺傳距離都在0.7~1.0之間。。
步驟四,繁殖群體內(nèi)親本自由組合交配,生產(chǎn)、培育子代半滑舌鰨至性成熟。
步驟五,以子代半滑舌鰨為新一代親本,重復(fù)操作步驟一至四,直到子代半滑舌鰨群體成為生長速度快、體重大的新品種半滑舌鰨。
本實(shí)施方式得到1個新品種半滑舌鰨。
將海陽市黃海水產(chǎn)有限公司的另外300尾半滑舌鰨作為對照組,與本實(shí)施方式獲得的1個新品種半滑舌鰨進(jìn)行對比,在養(yǎng)殖條件相同的情況下,本實(shí)施方式獲得的1個新品種半滑舌鰨的生長速度比對照組平均快26.23%,本實(shí)施方式獲得的1個新品種半滑舌鰨的體重比對照組平均重27.43%。
序列表
<110>海陽市黃海水產(chǎn)有限公司
中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
<120>新品種半滑舌鰨的分子選育方法
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序列表
<110>海陽市黃海水產(chǎn)有限公司
中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
<120>新品種半滑舌鰨的分子選育方法
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<213>人工序列
<220>
<223>微衛(wèi)星標(biāo)記引物(19)的下游引物
<400>38
ctacctctgcttcagctgtg20
<210>39
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>微衛(wèi)星標(biāo)記引物(20)的上游引物
<400>39
tctttaccgagaatctccctcc22
<210>40
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>微衛(wèi)星標(biāo)記引物(20)的下游引物
<400>40
aaagggcctaccgaaagaat20