本發(fā)明屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合固定化酶載體材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

固定化酶因比游離酶具有較好的溫度和ph穩(wěn)定性、可重復(fù)使用性以及催化產(chǎn)物易分離等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)藥、食品等眾多領(lǐng)域。固定化酶載體材料的選擇是決定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。理想的載體材料應(yīng)具備良好的機械強度、化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及對酶的高度親和性，并能保持較高的酶活性等。固定化酶的載體材料已從最初的天然高分子材料發(fā)展到合成高分子材料、無機材料，以及現(xiàn)在的復(fù)合材料等。

金屬-有機骨架(mofs)材料是一種新型的有機-無機雜化多孔材料，由金屬離子或金屬簇通過共價鍵與有機配體連接而成，具有比表面積大、孔隙率高、熱穩(wěn)定性好、可后功能化修飾等優(yōu)點，是理想的固定化酶載體之一。

目前，mofs材料固定化酶的方法多采用截留法與交聯(lián)法。截留法是將酶截留在mofs材料的孔道中。即將酶懸浮在溶液中，通過加入mofs材料，酶被截留在孔道中。截留法是一種最簡單的方法，也不會改變酶的結(jié)構(gòu)。然而研究發(fā)現(xiàn)，目前報道的大多數(shù)mofs材料孔徑尺寸雖然可調(diào)，但一般為微孔結(jié)構(gòu)(孔徑2nm左右)，因此酶分子的尺寸對負(fù)載起到關(guān)鍵性作用，多數(shù)mofs材料由于孔徑比較小而只能負(fù)載分子直徑較小的酶分子，這就限制了截留法的應(yīng)用。交聯(lián)法是使用交聯(lián)劑(一般是戊二醛)，通過與酶蛋白上的官能團形成共價鍵的方式，將酶固定在載體上，交聯(lián)法雖然使酶與載體形成的作用更強，結(jié)合得更牢固，但是會出現(xiàn)酶活力下降的現(xiàn)象。

也有少量的研究采用后合成修飾方法，使mofs材料表面帶有可與酶反應(yīng)的功能基團來達到固定化酶的目的，但所引入的功能基團并不多，最終導(dǎo)致只有少量的酶通過物理吸附或者共價鍵結(jié)合在mofs材料的表面，酶的固載量并未有大幅度的提高。

如何選擇理想的固定化酶載體，使其在提高酶穩(wěn)定性的同時，又大量引入可與酶結(jié)合的活性位點，是現(xiàn)在固定化酶技術(shù)要解決的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種富含大量活性位點的高分子材料與金屬-有機骨架材料的復(fù)合固定化酶載體材料及其制備方法和應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問題所采用的復(fù)合固定化酶載體材料是將uio-66-nh2與3-溴丙炔反應(yīng)引入炔基后，再與式i所示的端基為疊氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)，然后水解，得到的粒徑為280～320nm的納米顆粒。

式i中n表示甲基丙烯酸叔丁酯結(jié)構(gòu)單元的聚合度，n的取值優(yōu)選80～100。

上述的復(fù)合固定化酶載體材料合成路線和具體制備方法如下：

1、在惰性氣體保護下，以n,n-二甲基甲酰胺(dmf)為溶劑，將uio-66-nh2與3-溴丙炔、碳酸鉀按摩爾比為1:(6～8):(10～12)，60～80℃反應(yīng)24～36小時，得到炔基修飾的uio-66-nh2。

2、以cubr為催化劑、五甲基二乙烯三胺(pmdeta)為配體、丁酮和異丙醇體積比為1:1的混合液為溶劑，將甲基丙烯酸叔丁酯在2-疊氮乙基-2-溴-甲基丙酯引發(fā)下進行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，得到端基為疊氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯(n3-ptbma)。

3、以五水硫酸銅和抗壞血酸鈉為催化體系，將炔基修飾的uio-66-nh2和n3-ptbma發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)，所得產(chǎn)物(ptbma@uio-66-nh2)用三氟乙酸(tfa)水解，得到復(fù)合固定化酶載體材料(pmaa@uio-66-nh2)。

上述步驟2中，優(yōu)選2-疊氮乙基-2-溴-甲基丙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、cubr、五甲基二乙烯三胺的摩爾比為1:(100～120):(1～2):(1～2)。

上述步驟2中，進一步優(yōu)選原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)的溫度為50～70℃、時間為6～12小時。

上述步驟3中，優(yōu)選炔基修飾的uio-66-nh2與端基為疊氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯、五水硫酸銅、抗壞血酸鈉的摩爾比為1:(7.2～9):6:12，端基為疊氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯與三氟乙酸摩爾比為1:5～10。

上述步驟3中，進一步優(yōu)選點擊化學(xué)反應(yīng)的溫度為常溫、時間為48～72小時。

本發(fā)明復(fù)合固定化酶載體材料在固定果膠酶中的用途，具體使用方法為：將果膠酶加入ph值為4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，配制成8～12u/ml的果膠酶溶液，然后向果膠酶溶液中加入復(fù)合固定化酶載體材料，室溫反應(yīng)60～120分鐘，離心，用緩沖液洗滌，得到固定化果膠酶。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明的復(fù)合固定化酶載體材料制備方法簡單，其具有高穩(wěn)定性、豐富的表面官能團等特點。本發(fā)明通過羧基與氨基間的靜電吸附作用將果膠酶固定在該載體材料上，提高了果膠酶穩(wěn)定性的同時又大大增加了可與果膠酶結(jié)合的活性位點，果膠酶的吸附量高，最高達到了89.7％，該固定化果膠酶有著較好的ph、溫度和儲存穩(wěn)定性以及較好的重復(fù)使用性，重復(fù)使用8次后的相對酶活力仍為81％，在固定化酶領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。本發(fā)明復(fù)合固定化酶載體材料還可用于固定其他酶。

附圖說明

圖1是uio-66-nh2(a)、炔基修飾的uio-66-nh2(b)、ptbma@uio-66-nh2(c)、pmaa@uio-66-nh2(d)的pxrd譜圖。

圖2是uio-66-nh2(a)、炔基修飾的uio-66-nh2(b)、ptbma@uio-66-nh2(c)、pmaa@uio-66-nh2(d)的紅外光譜圖。

圖3是n3-ptbma的核磁氫譜圖。

圖4是uio-66-nh2的tem圖。

圖5是pmaa@uio-66-nh2的tem圖。

圖6是游離果膠酶和實施例1中載體材料固定化果膠酶的ph穩(wěn)定性。

圖7是游離果膠酶和實施例1中載體材料固定化果膠酶的溫度穩(wěn)定性。

圖8是游離果膠酶和實施例1中載體材料固定化果膠酶的儲存穩(wěn)定性。

圖9是實施例1中載體材料固定化果膠酶的重復(fù)使用性。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

1、將0.5g(0.285mmol)uio-66-nh2固體溶于20mldmf中，加入0.13ml(1.71mmol)3-溴丙炔和0.4g(2.91mmol)碳酸鉀，在氮氣氛圍下70℃反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，依次用dmf、去離子水和無水乙醇各洗滌3次，室溫真空干燥，得到炔基修飾的uio-66-nh2。

2、將0.11g(0.5mmol)2-疊氮乙基-2-溴-甲基丙酯、7.1g(50mmol)tbma和0.0865g(0.5mmol)pmdeta溶解于5ml無水丁酮和異丙醇體積比為1:1的混合液中，連續(xù)凍融脫氣兩次后加入0.0715g(0.5mmol)cubr，再凍融脫氣一次，然后在60℃氮氣氛圍下反應(yīng)12小時，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，用四氫呋喃稀釋后過中性氧化鋁柱，將洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑，然后在甲醇和水體積比為7:3的混合溶劑中沉淀，過濾，室溫真空干燥，得到白色固體n3-ptbma。

3、將0.0396g(0.02mmol)炔基修飾的uio-66-nh2、1.82g(0.15mmol)n3-ptbma分散于水和dmf體積比為1:1的混合溶劑中，然后加入0.03g(0.12mmol)五水硫酸銅和0.047g(0.24mmol)抗壞血酸鈉，室溫反應(yīng)48小時，離心分離，沉淀依次用dmf、去離子水和無水乙醇洗滌后，室溫真空干燥，得到ptbma@uio-66-nh2。將所得ptbma@uio-66-nh2加入到10ml含0.09ml(1.2mmol)三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室溫反應(yīng)24小時，離心分離，沉淀依次用四氫呋喃、去離子水洗滌后，室溫真空干燥，得到pmaa@uio-66-nh2，即復(fù)合固定化酶載體材料。

發(fā)明人采用粉末x-射線衍射儀、紅外光譜儀、核磁共振儀、凝膠滲透色譜儀、透射電子顯微鏡對所得樣品進行表征，結(jié)果見圖1-6。由圖1可見，與uio-66-nh2相比，炔基修飾的uio-66-nh2、ptbma@uio-66-nh2、pmaa@uio-66-nh2各個峰位置及強度幾乎完全相同，這說明接枝聚合物以后，uio-66-nh2的晶體結(jié)構(gòu)保持不變，即uio-66-nh2作為載體骨架材料具有良好的穩(wěn)定性。在圖2中，與曲線a對比，曲線b中2117cm^-1處為炔基的伸縮振動峰，表明uio-66-nh2炔基化成功；曲線c中2117cm^-1處炔基的伸縮振動峰消失，且1391cm^-1處出現(xiàn)一個寬峰，表明ptbma成功接枝在了uio-66-nh2表面；曲線d中1391cm^-1中寬峰消失，表明水解反應(yīng)成功。由圖3可見，δ＝1.34處為上述步驟2制備的白色固體n3-ptbma中叔丁基的峰，表明原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)成功。經(jīng)凝膠滲透色譜測試，上述步驟2制備的白色固體n3-ptbma中甲基丙烯酸叔丁酯結(jié)構(gòu)單元的聚合度為84，pdi為1.045。圖4和圖5可以看出，形成了明顯的核殼結(jié)構(gòu)，證明pmaa成功接枝在了uio-66-nh2表面。

實施例2

實施例1的復(fù)合固定化酶載體材料在固定果膠酶中的應(yīng)用，具體方法如下：

將果膠酶加入ph值為4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，配制成10u/ml的果膠酶溶液，然后向25ml果膠酶溶液中加入10mg復(fù)合固定化酶載體材料，室溫反應(yīng)120分鐘，在4000rpm下離心5分鐘，沉淀用ph＝4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液洗滌，得到固定化果膠酶，于4℃保存。

為了確定本發(fā)明復(fù)合固定化酶載體材料固定果膠酶的最佳工藝條件，發(fā)明人進行了大量的實驗室研究試驗，具體試驗情況如下：

1、固定化時間對果膠酶活力和吸附量的影響

以pmaa@uio-66-nh2為載體固定化果膠酶，固定化時間分別為15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、150分鐘，其他步驟與實施例2相同。采用紫外-可見分光光度計測試不同固定化時間對應(yīng)體系的吸光度，并根據(jù)下述公式(1)和(2)分別計算酶活力和酶吸附量，結(jié)果見表1。

其中：a—樣品液的od520值；a0—対照液的od520值；v—反應(yīng)液體積25ml；t—反應(yīng)時間，單位分鐘；k—常數(shù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，數(shù)值上等于od520為1時所相當(dāng)?shù)膁-半乳糖醛酸的微克數(shù)；稀釋倍數(shù)＝25倍。

表1不同固定化時間下果膠酶的酶活力和吸附量

表1結(jié)果顯示，在120分鐘時，酶活力和吸附量達到最大，分別為1.215u/mg和448.5mg/g。隨固定化時間的繼續(xù)增加，酶活力下降，酶吸附量保持不變，因此選取120分鐘為最佳固定化時間。

2、酶濃度對果膠酶活力和吸附量的影響

以pmaa@uio-66-nh2為載體固定化果膠酶，固定化實驗分為7組，各組果膠酶濃度為2u/ml、4u/ml、6u/ml、8u/ml、10u/ml、12u/ml，其他步驟與實施例2相同。采用紫外-可見分光光度計測試不同果膠酶濃度對應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)上述公式(1)和(2)分別計算酶活力和酶吸附量，結(jié)果見表2。

表2不同酶濃度下果膠酶的酶活力和吸附量

表2結(jié)果顯示，在果膠酶濃度為2～10u/ml時，酶活力隨果膠酶濃度的增加而增加，載體材料的吸附量也增加，當(dāng)果膠酶濃度大于10u/ml時，酶活力顯著下降，而吸附量繼續(xù)增加。綜合酶活力和吸附量考慮，本發(fā)明選取10u/ml作為果膠酶溶液的最佳濃度。

3、ph值對果膠酶活力和吸附量的影響

以pmaa@uio-66-nh2為載體固定化果膠酶，固定化實驗分為7組，各組ph值為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他步驟與實施例2相同。采用紫外-可見分光光度計測試不同ph值對應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)上述公式(1)和(2)分別計算酶活力和酶吸附量，結(jié)果見表3。

表3不同ph值下果膠酶的酶活力和吸附量

由表3結(jié)果可知，隨ph值的增加，酶活力和吸附量均是先增加后減小，酶活力在ph＝6.0時達最大值1.205u/mg，酶吸附量在ph＝4.0時達最大值447mg/g。綜合兩者結(jié)果，本發(fā)明選擇固定化酶的最適ph值為4.0。

4、溫度對果膠酶活力和吸附量的影響

以pmaa@uio-66-nh2為載體固定化果膠酶，固定化實驗分為7組，各組溫度為10℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃，其他步驟與實施例2相同。采用紫外-可見分光光度計測試不同溫度對應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)上述公式(1)和(2)分別計算酶活力和酶吸附量，結(jié)果見表4。

表4不同溫度下果膠酶的酶活力和吸附量

由表4結(jié)果可知，果膠酶在低溫下具有較高的活性，并且在25℃具有最大值，然后隨溫度的升高，酶活力顯著降低；當(dāng)反應(yīng)溫度低于50℃時，酶吸附量隨溫度的升高而增高，當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)增大時，酶吸附量急劇下降。綜合酶活力和酶吸附量，本發(fā)明選擇固定化酶的最適溫度為25℃。

綜合以上結(jié)果可知，果膠酶濃度為10u/ml，體系ph為4.0，25℃下固定120分鐘的條件為最佳。在此條件下，最高酶活力為1.215u/mg，酶的最大吸附量為448.5mg/g。

為了確定本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人對游離果膠酶以及實施例2中固定化果膠酶的性能進行了測試，具體如下：

1、游離果膠酶和固定化果膠酶的ph穩(wěn)定性

向相同體積、不同ph值(ph值分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中加入果膠，使果膠最終濃度為10u/ml，再分別加入等量酶活的固定化果膠酶或游離果膠酶，40℃振蕩反應(yīng)30分鐘，測定游離果膠酶和固定化果膠酶在不同ph條件下的酶活力。以酶活力最高值為100％，計算不同ph條件下的相對酶活力，結(jié)果如圖6所示。

從圖6可以看出，在ph為2.2～7.0變化時，游離果膠酶和固定化果膠酶相對活性變化趨勢相似，最大酶活力均出現(xiàn)在ph＝4.0，雖然固定化果膠酶與游離果膠酶相比，在ph＝4.0條件下酶活性稍微降低，但其可以在較寬的ph范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定且較高的酶活性。

2、游離果膠酶和固定化果膠酶的溫度穩(wěn)定性

向相同體積、ph均為4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中加入果膠，使果膠最終濃度為10u/ml，再分別加入等量酶活的固定化果膠酶或游離果膠酶，將上述反應(yīng)液分別在20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下振蕩反應(yīng)30分鐘，測定游離果膠酶和固定化果膠酶在不同溫度下的酶活力。以酶活力最高值為100％，計算不同溫度條件下的相對酶活力，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可見，游離果膠酶和固定化果膠酶的最大酶活性均出現(xiàn)在50℃，低于50℃時，游離果膠酶和固定化果膠酶都是隨著溫度升高酶活力增加，高于50℃后酶活力不斷降低。在70℃時，游離果膠酶酶活力只有最高酶活力的61％，而固定化果膠酶在70℃時仍能保持80％的酶活力。與游離果膠酶相比，雖然固定化果膠酶在50℃的活性相對較低，但其酶活性相對穩(wěn)定，受溫度的變化影響較小。

3、游離果膠酶和固定化果膠酶的儲存穩(wěn)定性

將固定化果膠酶和游離果膠酶置于4℃冰箱貯存，在一定的時間間隔內(nèi)，測定酶活力。以初始酶活力為100％，計算固定化果膠酶和游離果膠酶經(jīng)不同儲存時間后的殘余酶活力，測定結(jié)果如圖8所示。

由圖8可見，游離果膠酶和固定化果膠酶的活性半衰期分別在14天和27天。由此可見，固定化果膠酶在儲存穩(wěn)定性方面較游離果膠酶有著顯著的提高，特別是有著更長的活性持續(xù)時間。

4、固定化果膠酶的重復(fù)使用性

向ph＝4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中加入果膠，使果膠最終濃度為10u/ml，配制成果膠溶液；將10mg固定化果膠酶加入到25ml果膠溶液中，40℃反應(yīng)30分鐘后，4000rpm下離心5分鐘，沉淀用ph＝4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液洗滌后再加入到新的果膠溶液中，重復(fù)上述步驟，在520nm處測定每次反應(yīng)的酶活性。結(jié)果見圖9。

由圖9可見，隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加，固定化果膠酶的相對活性逐漸降低，但是重復(fù)使用8次后，酶的相對活性仍保留81％，說明固定化果膠酶有著較好的重復(fù)使用性。