本發(fā)明涉及動物病原分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及到一種檢測新生仔豬常見垂直傳播病原的采樣方法及檢測方法。
背景技術(shù)：
：豬的垂直傳播疾病是指母豬所患有的某種疾病其病原體可經(jīng)卵巢、胎盤直接傳播給仔豬，幾乎所有的垂直傳播病原均可以水平傳播，引發(fā)仔豬大范圍和長時間的感染，造成仔豬生長發(fā)育受到抑制，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成困擾和巨大的經(jīng)濟損失。新生仔豬感染的常見垂直傳播病原有豬瘟病毒(csfv)、豬細小病毒(ppv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)、日本乙型腦炎病毒(jev)、流行性腹瀉病毒(ped)、豬傳染性胃腸炎病毒(tge)、豬支原體、豬衣原體和弓形蟲?？刂拼怪眰鞑ゼ膊〉藐P(guān)鍵在于預防，因此對新生仔豬常見垂直傳播病原的檢疫與監(jiān)測至關(guān)重要。樣品采集是檢測的重要環(huán)節(jié)之一，關(guān)系到檢測的準確性與檢測效率。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種檢測新生仔豬常見垂直傳播病原的采樣方法及檢測方法，本發(fā)明的新生仔豬的采樣方法及檢測方法，采樣部位為胎衣、臍帶血、扁桃體、血液、鼻拭子、喉拭子和肛拭子，通過對上述采樣部位的pcr檢測，可判斷仔豬是否感染常見垂直傳播病原，本發(fā)明簡單方便、針對性強，通過對新生仔豬的常見垂直傳播病原的檢測，有利于豬群疾病預防和凈化。本發(fā)明提供的一種檢測新生仔豬常見垂直傳播病原的采樣方法，包括通過胎衣、臍帶血、扁桃體、血液、鼻拭子、喉拭子和肛拭子對垂直傳播病原的采樣。上述的采樣方法，其中，所述通過胎衣采樣的步驟包括：用無菌剪刀在不同部位剪5塊1-2cm2大小面積的胎衣，置于無菌離心管中；所述通過臍帶血采樣的步驟包括：取仔豬臍帶，在中段剪開，將臍帶血擠入無菌干燥的青霉素瓶中，3～5滴，作為待檢樣品；所述通過扁桃體采樣的步驟包括：利用扁桃體采樣器進行采集，具體為首先固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采取扁桃體樣品，用滅菌牙簽挑至無菌離心管中并作標記；所述通過血液采樣的步驟包括：將豬面朝上固定，全身成一直線，前肢上抬，在兩側(cè)第一對肋骨與胸骨結(jié)合處的前方會出現(xiàn)左右兩個明顯的凹陷窩，將皮膚消毒，將注射器向右側(cè)凹陷窩處由上而下，稍偏向中央及胸腔方向刺入，見有回血，即可采血，將血液以3000r/min離心10分鐘，取血清作為待檢樣品。上述的采樣方法，其中，所述通過鼻拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入仔豬鼻腔中，沿鼻腔壁輕輕轉(zhuǎn)動3～5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋；所述通過喉拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入仔豬咽部，轉(zhuǎn)動3～5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋；所述通過肛拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入仔豬肛門，轉(zhuǎn)動3～5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋。上述的采樣方法，其中，所述扁桃體采樣方法可用于檢測豬瘟病毒；所述臍帶血采樣方法可用于檢測豬細小病毒或豬圓環(huán)病毒2型或弓形蟲；所述血液采樣方法可用于檢測豬圓環(huán)病毒2型或豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述鼻拭子、喉拭子采樣方法可用于檢測豬偽狂犬病毒或豬支原體病毒或豬衣原體；所述胎衣采樣方法可用于檢測日本乙型腦炎病毒或豬細小病毒；所述肛拭子采樣方法可用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒或流行性腹瀉病毒。本發(fā)明還提供了一種檢測新生仔豬常見垂直傳播病原的檢測方法，包括豬瘟病毒的檢測、豬細小病毒的檢測、豬圓環(huán)病毒2型的檢測、豬偽狂犬病毒的檢測、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測、日本乙型腦炎病毒的檢測、流行性腹瀉病毒的檢測、豬傳染性胃腸炎病毒的檢測、豬支原體的檢測、豬衣原體的檢測、弓形蟲的檢測。上述的檢測方法，其中，所述豬瘟病毒的檢測方法包括：取采集的扁桃體，剪碎勻漿，取勻漿液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-aaacggagggactagccat-3'r5'-tgccatacagcagaga-3'目的條帶為252bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。上述的檢測方法，其中，所述豬細小病毒的檢測方法包括：取采集的臍帶血和胎衣，提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-atacaattctatttcatgggccagc-3'r5'-tatgttctggtctttcctcgcatc-3'目的片段為330bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，62℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min；所述豬圓環(huán)病毒2型的檢測方法包括：取采集的血清或臍帶血，提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-ggatattgtagtcctggtcg-3'r5'-tcccgcaccttcggatatac-3'目的片段為360bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。上述的檢測方法，其中，所述豬偽狂犬病毒的檢測方法包括：取采集的鼻拭子和喉拭子，在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：5'-agtactcgcaggggcgcact-3'5'-cgccgatcttggtgtaggtgt-3'目的片段為375bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min：所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法包括：取采集的血清提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：5'-gaccatatgccaaataacaacggc-3'5'-attctcgagtgctgagggtgatgctgctg-3'目的片段為340bp或430bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min，其中目的片段340bp為高致病性毒株，目的片段430bp為經(jīng)典毒株。上述的檢測方法，其中，所述日本乙型腦炎病毒檢測方法包括：取采集的胎衣剪碎勻漿，取勻漿液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-aacagcatgcaaatcgaagac-3'r5'-ccagaaacatcaccagaagg-3'。目的片段為660bp，擴增程序為：95℃30s，55℃30s，72℃40s，35個循環(huán)，72℃10min；所述流行性腹瀉病毒的檢測方法包括：取采集的肛拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-ggacacattcttggtggtct-3’r5’-gtttagactaaatgaagcactttc-3’目的片段為375bp，擴增程序為：94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。上述的檢測方法，其中，所述豬傳染性胃腸炎病毒的采樣方法包括：取采集的肛拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-ttgtggttttggttgtaatgcc-3’r5’-ggctgtttggtaactaatttacca-3’目的片段為874bp，擴增程序為：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述豬支原體的檢測方法包括：取采集的鼻拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-ggcgaatgggtgagtaacacg-3’r5’-cggataacgcttgcgacctatg-3’目的片段為300-400bp，擴增程序為：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述豬衣原體的檢測方法包括：取采集的鼻拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-gcgtctcggctattatgg-3’r5’-gaggtttgttgatggtgaat-3’目的片段為540bp，擴增程序為：94℃5min，94℃1min，50℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述弓形蟲檢測方法包括：取采集的臍帶血提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-gtatgtttccgaaggcagtga-3’r5’-gtgagtacgcaagagtggg-3’目的片段為241bp，94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明能夠較全面的檢測仔豬常見垂直傳播病原，操作簡單，所需時間短，針對性強，避免了傳統(tǒng)采樣檢測方法操作繁瑣、耗時長、檢出率低等缺點，有利于新生仔豬疾病防控和凈化。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明及其特征、外形和優(yōu)點將會變得更明顯。在全部附圖中相同的標記指示相同的部分。并未刻意按照比例繪制附圖，重點在于示出本發(fā)明的主旨。圖1為本發(fā)明中實施例1的電泳圖。圖2為本發(fā)明中實施例2的電泳圖。圖3為本發(fā)明中實施例3的電泳圖。具體實施方式在下文的描述中，給出了大量具體的細節(jié)以便提供對本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明可以無需一個或多個這些細節(jié)而得以實施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進行描述。為了徹底理解本發(fā)明，將在下列的描述中提出詳細的步驟以及詳細的結(jié)構(gòu)，以便闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的較佳實施例詳細描述如下，然而除了這些詳細描述外，本發(fā)明還可以具有其他實施方式。參照圖1-圖3所示，本發(fā)明提供了一種檢測新生仔豬常見垂直傳播病原的采樣方法，包括通過胎衣、臍帶血、扁桃體、血液、鼻拭子、喉拭子和肛拭子對垂直傳播病原的采樣。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述通過胎衣采樣的步驟包括：用無菌剪刀在不同部位剪5塊1-2cm2大小面積的胎衣，置于無菌離心管中；所述通過臍帶血采樣的步驟包括：取仔豬臍帶，在中段剪開，將臍帶血擠入無菌干燥的青霉素瓶中，3～5滴，作為待檢樣品；所述通過扁桃體采樣的步驟包括：利用扁桃體采樣器進行采集，具體為首先固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采取扁桃體樣品，用滅菌牙簽挑至無菌離心管中并作標記；所述通過血液采樣的步驟包括：將豬面朝上固定，全身成一直線，前肢上抬，在兩側(cè)第一對肋骨與胸骨結(jié)合處的前方會出現(xiàn)左右兩個明顯的凹陷窩，將皮膚消毒，將注射器向右側(cè)凹陷窩處由上而下，稍偏向中央及胸腔方向刺入，見有回血，即可采血，將血液以3000r/min離心10分鐘，取血清作為待檢樣品。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述通過鼻拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入仔豬鼻腔中，沿鼻腔壁輕輕轉(zhuǎn)動3～5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋；所述通過喉拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入仔豬咽部，轉(zhuǎn)動3～5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋；所述通過肛拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入仔豬肛門，轉(zhuǎn)動3～5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述扁桃體采樣方法可用于檢測豬瘟病毒；所述臍帶血采樣方法或胎衣可用于檢測豬細小病毒或豬圓環(huán)病毒2型或弓形蟲；所述血液采樣方法可用于檢測豬圓環(huán)病毒2型或豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述鼻拭子、喉拭子采樣方法可用于檢測豬偽狂犬病毒或豬支原體病毒或豬衣原體；所述胎衣采樣方法可用于檢測日本乙型腦炎病毒；所述肛拭子采樣方法可用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒或流行性腹瀉病毒。本發(fā)明另一面，還提供一種檢測新生仔豬常見垂直傳播病原的檢測方法，包括豬瘟病毒的檢測、豬細小病毒的檢測、豬圓環(huán)病毒2型的檢測、豬偽狂犬病毒的檢測、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測、日本乙型腦炎病毒的檢測、流行性腹瀉病毒的檢測、豬傳染性胃腸炎病毒的檢測、豬支原體的檢測、豬衣原體的檢測、弓形蟲的檢測。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述豬瘟病毒的檢測方法包括：取采集的扁桃體，剪碎勻漿，取勻漿液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-aaacggagggactagccat-3'r5'-tgccatacagcagaga-3'目的條帶為252bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述豬細小病毒的檢測方法包括：取采集的臍帶血和胎衣，提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-atacaattctatttcatgggccagc-3'r5'-tatgttctggtctttcctcgcatc-3'目的片段為330bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，62℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min；所述豬圓環(huán)病毒2型的檢測方法包括：取采集的血清或臍帶血，提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-ggatattgtagtcctggtcg-3'r5'-tcccgcaccttcggatatac-3'目的片段為360bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述豬偽狂犬病毒的檢測方法包括：取采集的鼻拭子和喉拭子，在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：5'-agtactcgcaggggcgcact-3'5'-cgccgatcttggtgtaggtgt-3'目的片段為375bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min：所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法包括：取采集的血清提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：5'-gaccatatgccaaataacaacggc-3'5'-attctcgagtgctgagggtgatgctgctg-3'目的片段為340bp或430bp，擴增程序為：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min，其中目的片段340bp為高致病性毒株，目的片段430bp為經(jīng)典毒株。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述日本乙型腦炎病毒檢測方法包括：取采集的胎衣剪碎勻漿，取勻漿液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5'-aacagcatgcaaatcgaagac-3'r5'-ccagaaacatcaccagaagg-3'。目的片段為660bp，擴增程序為：95℃30s，55℃30s，72℃40s，35個循環(huán)，72℃10min；所述流行性腹瀉病毒的檢測方法包括：取采集的肛拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-ggacacattcttggtggtct-3’r5’-gtttagactaaatgaagcactttc-3’目的片段為375bp，擴增程序為：94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。本發(fā)明一優(yōu)選而非限制性的實施例中，所述豬傳染性胃腸炎病毒的采樣方法包括：取采集的肛拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-ttgtggttttggttgtaatgcc-3’r5’-ggctgtttggtaactaatttacca-3’目的片段為874bp，擴增程序為：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述豬支原體的檢測方法包括：取采集的鼻拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-ggcgaatgggtgagtaacacg-3’r5’-cggataacgcttgcgacctatg-3’目的片段為300-400bp，擴增程序為：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述豬衣原體的檢測方法包括：取采集的鼻拭子在生理鹽水中輕輕攪拌，并浸泡10分鐘，取浸泡液提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-gcgtctcggctattatgg-3’r5’-gaggtttgttgatggtgaat-3’目的片段為540bp，擴增程序為：94℃5min，94℃1min，50℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述弓形蟲檢測方法包括：取采集的臍帶血提取病毒dna，進行pcr擴增，擴增引物為：f5’-gtatgtttccgaaggcagtga-3’r5’-gtgagtacgcaagagtggg-3’目的片段為241bp，94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。以下提供具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。實施例1對新生仔豬進行細小病毒檢測，陽性對照為細胞培養(yǎng)的豬細小病毒，陰性對照為雙蒸水。1.1引物設(shè)計根據(jù)ppv保守區(qū)序列設(shè)計引物進行擴增，擴增片段為330bp。5'-aaacggagggactagccat-3'5'-tgccatacagcagaga-3'1.2病料處理和核酸提取取采集的臍帶血樣品，具體為取仔豬臍帶，在中段剪開，將臍帶血擠入無菌干燥的青霉素瓶中，3～5滴；同時取胎衣，作為待檢樣品，參照病毒dna提取說明書提取病毒dna。1.3pcr擴增取所得dna模板2μl，2×taqmix10μl，ppv上、下游引物各1μl，加ddh2o至反應(yīng)體系為20μl，混勻后進行擴增。擴增程序為95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。取pcr擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。1.4結(jié)果參照圖1所示，豬細小病毒陽性對照和檢測的新生仔豬臍帶血樣品出現(xiàn)330bp目的條帶；陰性對照未出現(xiàn)條帶。1.5實際應(yīng)用利用本實施例的采樣和檢測方法，對15頭發(fā)病或死亡仔豬進行了rt-pcr檢測，同時與常規(guī)采樣和檢測方法進行比較。常規(guī)方法采集發(fā)病豬或死亡豬取的肝臟、肺臟、腎臟、睪丸和腸系膜淋巴結(jié)，并對樣品進行研磨、勻漿、離心，平均每頭耗時35分鐘，在15份病料中檢出豬細小病毒陽性數(shù)4份；本實施例采集15頭仔豬的臍帶血和胎衣進行處理，平均每頭耗時5分鐘，檢出豬細小病毒陽性數(shù)4份。表1常規(guī)方法與本發(fā)明檢測豬細小病毒對比采樣數(shù)平均采樣耗時(分鐘)陽性數(shù)陽性率1535426.7％155426.7％從表1可以得出，用本實施例的方式進行采樣，可以縮短采樣時間，而且采樣的過程更加的簡單，從而可以快速的檢出豬細小病毒。實施例2對新生仔豬進行豬瘟病毒檢測。陽性對照為豬瘟活疫苗(細胞源)，購自普萊克生物工程股份有限公司。2.1引物設(shè)計根據(jù)csfv保守區(qū)序列設(shè)計引物進行擴增，擴增片段為252bp。5'-aaacggagggactagccat-3'5'-tgccatacagcagaga-3'2.2病料處理和核酸提取取采集的扁桃體，剪碎后進行勻漿，參照病毒dna/rna提取說明書提取病毒rna，將所得總rna按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cdna；2.3pcr擴增取所得cdna模板2μl，2×taqmix10μl，csfv上、下游引物各1μl，加ddh2o至反應(yīng)體系為20μl，混勻后進行擴增。擴增程序為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。取pcr擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。2.4結(jié)果參照圖2所示，豬瘟病毒陽性對照出現(xiàn)252bp目的條帶；檢測樣品和陰性對照未出現(xiàn)條帶。2.5實際應(yīng)用利用本實施例的采樣和檢測方法，對25頭發(fā)病豬或死亡豬進行了rt-pcr檢測，同時與常規(guī)采樣和檢測方法進行比較。常規(guī)方法采集發(fā)病豬或死亡豬的脾臟、淋巴結(jié)和腎臟，并對樣品進行研磨、勻漿、離心，平均每頭耗時30分鐘，在25份病料中檢出豬瘟陽性數(shù)8份；本發(fā)明采集扁桃體進行處理，平均每頭耗時10分鐘，檢出豬瘟陽性數(shù)8份。表2常規(guī)方法與本發(fā)明檢測豬瘟對比實施例3對新生仔豬進行prrsv檢測，陽性對照為豬繁殖與呼吸綜合征活病毒ch-1r株，購自上海海利生物藥品有限公司；陰性對照為雙蒸水。3.1引物設(shè)計根據(jù)prrsv基因組序列設(shè)計引物進行擴增，目的片段為340bp(高致病性毒株)或430bp(經(jīng)典毒株)。5'-gaccatatgccaaataacaacggc-3'5'-attctcgagtgctgagggtgatgctgctg-3'3.2病料處理和核酸提取取采集的血清樣品，參照病毒rna提取說明書提取病毒dna，將所得總rna按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cdna；3.3pcr擴增取所得cdna模板2μl，2×taqmix10μl，prrsv上、下游引物各1μl，加ddh2o至反應(yīng)體系為20μl，混勻后進行擴增。擴增程序為：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。取pcr擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。3.4結(jié)果參照圖3所示，prrsv陽性對照和檢測的新生仔豬血清血樣品均出現(xiàn)340bp目的條帶；陰性對照未出現(xiàn)條帶。3.5實際應(yīng)用利用本實施例的采樣和檢測方法，對30頭發(fā)病豬進行了rt-pcr檢測，同時與常規(guī)采樣和檢測方法進行比較。常規(guī)方法采集發(fā)病豬或死亡豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體，并對樣品進行研磨、勻漿、離心，平均每頭耗時35分鐘，在63份病料中檢出豬瘟陽性數(shù)13份；本發(fā)明采血進行處理，平均每頭耗時5分鐘，檢出豬瘟陽性數(shù)15份。表3常規(guī)方法與本發(fā)明檢測豬瘟對比采樣數(shù)平均采樣耗時(分鐘)陽性數(shù)陽性率30351343.3％3051550％從表3可以看出來，通過本實施例的采樣方式和檢測方法，相對于現(xiàn)有技術(shù)的采樣方法和檢測方法，可以縮短采樣時間，而且采樣的過程更加的簡單，以及通過本實施例的采樣方式，可以提高病毒的檢出率。實施例4臨床驗證采用本發(fā)明的方法采集臨床樣品，進行檢測，結(jié)果見下表。結(jié)果表明，本發(fā)明針對性強，對臨床樣本檢出率高。表4臨床檢測情況檢測項目采集樣品采集總數(shù)(份)陽性樣品(份)csfv扁桃體258ppv臍帶血、胎衣225pcv-2血清、臍帶血285prv鼻拭子、喉拭子5926prrsv血清6319jev胎衣224ped肛拭子3516tge肛拭子3212支原體鼻拭子2810衣原體鼻拭子、胎衣72弓形蟲臍帶血154以上對本發(fā)明的較佳實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，其中未盡詳細描述的設(shè)備和結(jié)構(gòu)應(yīng)該理解為用本領(lǐng)域中的普通方式予以實施；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護的范圍內(nèi)。當前第1頁12